G蛋白偶聯受體偏倚配體及其在心血管藥物研究中的應用

陳挺 張雪 翁海旭 馬超群 鄭興 肖良

G蛋白偶聯受體偏倚配體及其在心血管藥物研究中的應用

陳挺 張雪 翁海旭 馬超群 鄭興 肖良

G-蛋白偶聯受體（G-protein-coupled receptor, GPCR）藥物是目前臨床上應用最為廣泛的一類藥物，約占整個藥品市場份額的1/3。其中，它在心血管疾病中的應用尤為突出，包括降壓、強心、防止血栓形成等各個方面[1]。近年來，隨著對GPCR功能認識的不斷深入，越來越多的藥理學和遺傳學研究表明，GPCR信號通路具有靶向效應[2]?！捌信潴w”是一類可以將受體選擇性地穩定在不同構象的配體分子，能夠激活GPCR下游某些特定的信號通路，從而避免通路全部激活產生的不良反應，具有非常廣闊的臨床應用前景[3]。

1 G蛋白與β-arrestin介導的GPCR信號通路

GPCR基因家族在人類基因組中最為龐大，幾乎表達于機體所有組織中并影響體內幾乎所有的生理反應。GPCR與激素、神經遞質以及代謝產物等細胞外信號結合后發生構象變化，通過偶聯的相關功能蛋白觸發細胞內的信號反應。越來越多的研究表明，除異三聚體G蛋白之外，GPCR還可以偶聯多種細胞內信號蛋白并介導特定的信號通路[4]。作為許多功能蛋白的支架，β-arrestin是其中最為普遍的、發揮重要功能的調節蛋白，在有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、酪氨酸激酶信號通路以及磷酸酶相關的信號通路等多種信號通路中，它可以使胞內信號蛋白之間的聯系更為緊密從而有利于通路的活化[5]。隨著基因芯片等技術的應用，人們逐漸發現GPCR是通過復雜的信號網絡來發揮功能效應的GPCR藥理學概念將突破傳統標準得到不斷更新。

2 配體偏倚理論

經典的受體藥理學認為配體分子（激動劑或抑制劑）與某一特定GPCR結合后引起受體構象變化，通過單一的信號機制來發揮特定的功能效應。在這種模式主導下，經典受體藥理學根據單一配體-受體結合的親和力和效力差異將GPCR配體分為完全激動劑、部分激動劑、中性拮抗劑以及反向激動劑等類型。然而最新研究表明，除親和力和效力外，不同GPCR配體分子（激動劑或抑制劑）還可以結合相同或不同的GPCR觸發更為廣泛的信號網絡，通過對不同信號通路的選擇性而發揮特定的功能效應與藥理作用[4]。

最早關于偏倚配體的描述來源于α2腎上腺素受體（α2adrenergic receptor,α2-AR）的幾種激動劑可以分別偶聯Gαs、Gαi而產生不同效應的發現，研究者們據此推測不同配體分子可以通過誘導其受體的不同構象變化而產生特定的藥理作用。此后，不同垂體腺苷酸環化酶激活肽類似物引起完全相反的藥理效應、不同激動劑引起受體內化的差異等研究進一步支持了配體偏倚的理論。研究證實，偏倚配體能夠直接將受體穩定在不同的構象，激活特定的受體下游信號通路[6]。配體偏倚與系統無關，是配體-受體相互作用的固有特性，僅與細胞類型以及受體密度等因素有關[7]。盡管理論上配體偏倚可以發生于既定受體的任意兩個信號通路之間，如G蛋白與G蛋白之間的偏倚、β-arrestin不同亞型之間的偏倚甚至β-arrestin不同狀態之間的偏倚等，但G蛋白和β-arrestin偶聯是配體作用于受體后細胞內應答的第1步，且多數GPCR至少偶聯1個G蛋白和1個β-arrestin。因此G蛋白和β-arrestin之間的偏倚非常有利于實現GPCR的功能選擇性，代表了受體偏倚理論的一般機制，也是目前偏倚配體機制研究的熱點以及偏倚配體新藥研究的直接靶標[8-9]。

一般地，配體可以通過競爭受體內源性激動劑的結合位點或占據發揮特定變構調節作用的結合位點產生偏倚作用，目前配體偏倚的研究多圍繞受體內源性配體或某些常用的藥物相關信號通路進行。其中正位偏倚配體可能是參與完全激動劑引發的部分受體構象變化而產生對下游信號通路的功能選擇性。而變構偏倚配體則可能是通過作用于一個非標準的結合位點使受體直接穩定在特定的“活性”構象（變構激活）或者通過正位激動劑使受體不能形成某些特定構象（變構調節）而實現其功能選擇性，如CRTH2配體可以在不影響G蛋白信號通路的情況下阻斷激動劑對β-arrestin信號通路的激活效應、M1受體變構調節劑BQCA可以促進β-arrestin的結合以及NK2受體的配體LPI805促進Gαs的解離和Gαq的結合等[10-12]，這種類似于變構調節的功能選擇性被稱為“偏倚變構調節”，在偏倚配體新藥研究中得到了廣泛應用。

3 心血管受體的重要偏倚配體

心血管系統GPCR是目前新藥研究最成功的靶點，其中血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）1型受體（AT1R）、β腎上腺素能受體（β-Adrenergic Receptor,β-AR）以及煙酸受體是目前研究最多的心血管系統GPCR，也是偏倚配體新藥研究最具臨床應用潛力的作用靶點。

3.1 AT1R AngⅡ是腎素-血管緊張素系統的關鍵產物之一，能夠作用于AT1R等GPCR調節血管收縮和醛固酮分泌，在水電解質平衡過程中發揮重要作用。AT1R主要通過偶聯Gαq介導下游信號通路，對細胞內調節進行精細調控并廣泛參與其他信號通路的活化，包括PKC與GPCR激酶（G-protein-coupled receptor kinase, GRK）的磷酸化、受體內化、β-arrestin的募集與信號通路的活化、表皮生長因子受體的反式激活以及Src蛋白和JAK/STAT的激活等[13-14]。

AT1R介導的信號通路并不完全依賴于G蛋白，可以被偏倚配體活化。目前研究主要是通過誘導關鍵氨基酸突變來研究AngⅡ對AT1R構象的影響及其信號通路，如大鼠AT1aR的DRY模體（氨基酸125-127）突變可以阻斷其與Gαq偶聯但不影響AngⅡ引起的受體磷酸化、內化以及β-arrestin的募集等過程[15]，AT1R第2個胞內環突變會阻斷其與Gαq或Gαi的偶聯等[16]。體外siRNA干擾或體內基因敲除β-arrestin1或β-arrestin2的研究則表明β-arrestin參與了AT1R介導的ERK1/2、RHO、Mnk1、MDM2等多條信號通路活化過程[17-18]。研究還發現機械拉伸作用可以激活β-arrestin2而非G蛋白依賴性的信號通路，與ARB作用類似，AT1R或β-arrestin2敲除均會促進拉伸誘導的細胞凋亡，說明β-arrestin2在AT1R介導的藥理過程中發揮保護心臟的作用[19]。

使用選擇性激活β-arrestin信號通路的偏倚配體可以強化β-arrestin對AT1R的功能影響，如最為常用的AT1R偏倚配體1Sar-4Ile-8Ile-AngⅡ（SⅡ）可以通過偶聯β-arrestin促進AT1R磷酸化、內化及ERK的活化，卻不會偶聯G蛋白而避免促磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol,PI）在細胞膜上的翻轉[20]。另外，SⅡ偶聯β-arrestin后介導的ERK1/2信號通路可以促進蛋白質合成、生長與增殖，減少細胞凋亡以及增強心臟收縮力等，而不會出現AngⅡ結合后ERK1/2活化引起的心肌肥厚。這表明利用SⅡ等偏倚配體與內源性AngⅡ競爭AT1R，可以在拮抗部分AT1R不良反應的同時選擇性增強偏倚配體信號通路的藥理效應。之后，研究者們最近發現了一種比SⅡ效力更強的選擇性激活β-arrestin信號通路的AT1R偏倚配體TRV120027[21]，其優勢在于拮抗AngⅡ引起的高血壓的同時更高效地競爭AT1R從而增加心肌收縮力，改善心臟功能。相比之下，經典ARB與TRV120027的降壓效果相當，但無法改善心臟功能甚至在某些情況下會導致心臟功能的惡化[21]。對犬心力衰竭模型的研究表明，TRV120027可以降低動脈血壓和肺毛細血管楔壓，同時增加心輸出量、保護腎功能并改善急性心力衰竭癥狀，有望成為偏倚配體臨床藥物開發的典范[22-23]。

因此，從信號通路研究有效性的角度來看，AT1R是一個偏倚配體作用有效、藥理學效力明確的可用于新藥研究的成功例證。其偏倚配體如TRV120027不僅具有ARB抑制腎素-血管緊張素系統降血壓的功能，還具備β-arrestin信號通路激活的特定藥理學作用，可能對急性心力衰竭、心功能下降以及神經內分泌過度活化和系統性全身血管阻力升高等疾病具有良好的治療或保護作用[24]。

3.2 β-AR β-AR阻滯劑自發現以來一直都是臨床上最重要的心血管系統藥物之一，能夠抑制內源性兒茶酚胺激活心臟β1-AR信號通路產生的變時、變力、變傳導作用，是目前臨床上治療心肌梗死、心律失常以及高血壓等心血管疾病的最常用藥物。相反，β2-AR激動劑能夠激活β2-AR信號通路而降低外周血管張力，也可降低氣道收縮性治療哮喘等呼吸系統疾病。

β-AR阻滯劑的療效非常顯著，以致于人們一度認為偏倚配體增強其療效的利用空間十分有限。然而，最近研究發現β1-AR通過偶聯β-arrestin可以磷酸化EKR1/2、反式激活EGF受體，發揮心臟保護作用[25]。進一步β1-AR基因突變研究發現，長期異丙腎上腺素刺激對GRK磷酸化位點表達缺失的GRK-β1AR[26]轉基因小鼠（不能募集β-arrestin）的心臟功能有損傷作用，而不會對PKA磷酸化位點缺失的PKA-β1AR轉基因小鼠（不能通過PKA脫敏）的心臟功能產生影響，提示β1-AR偶聯的G蛋白和β-arrestin信號通路之間存在一個與細胞凋亡相關的長期正性肌力作用和心臟保護作用之間的平衡。在β-arrestin信號通路缺失、平衡被打破的情況下，單獨偶聯G蛋白介導的信號通路會增加細胞凋亡并損傷心臟功能。另一條β1-AR激動劑相關的信號通路是心肌梗死后Ca2+/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（Ca2+/ calmodulin-dependent kinaseⅡ,Ca2+/CaMKⅡ）的活化。研究發現β-arrestin2對β1-AR募集激活Ca2+/CaMKⅡ并活化下游信號通路引起心臟功能的下降是十分必要的[27]，理論上這條通路可以抵消β1-AR偶聯β-arrestin發揮的心臟保護作用。但由于β1-AR偶聯β-arrestin激活Ca2+/CaMKⅡ的過程中需要cAMP，這條通路不大可能是由拮抗G蛋白通路cAMP生成的β-arrestin介導，β-arrestin偏倚配體的總藥理效應還應該是發揮心臟保護作用的。因此，非G蛋白依賴性偶聯β-arrestin信號通路的偏倚配體具有拮抗β1-AR信號通路、降低心臟功能的潛力。在最近一項研究測試的20種β-AR阻滯劑中，只有卡維地洛和阿普洛爾能夠激活β-arrestin介導的EGF受體反式激活信號途徑，發揮心臟保護作用[28]。研究表明，卡維地洛在治療心肌梗死后的心血管事件以及降低病死率方面具有較其他β-AR阻滯劑更大的優勢[29]。

4 偏倚配體新藥研究的驗證與挑戰

與傳統藥物靶點相比，偏倚配體的藥物開發更為復雜，因為它不僅需要驗證新藥靶點的相關性及其調節疾病狀態的潛力，還至少要檢測一條受體后不良反應相關的信號通路，從而在疾病中選擇最佳的藥物干預措施。盡管目前發現AT1R、β-AR及GPR109a等心血管系統重要受體具有獨立的藥理學作用和新的偏倚配體開發潛力，但總體而言配體偏倚新藥研究的成功案例非常少，可供參考的研究資料極為有限。其中的一個難點就在于缺乏區別內源性配體偏倚、特定條件下的功能選擇性或者不同研究體系之間功能差異的簡便判斷標準。從功能選擇性的角度，對偏倚配體基礎研究的吸引力在于檢測激動劑是否可以通過開發偏倚配體而“拯救”用于新藥研究的受體靶點。GPCR偏倚配體研究，尤其是對那些具有實際臨床意義但不良反應明顯的“問題”配體將具有重要的實用價值[30]。

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2016-02-22）

（本文編輯：馬雯娜）

國家自然科學基金面上項目（81470518，81170092）

200433 上海，第二軍醫大學長海醫院心內科（陳挺、鄭興）；中國藥科大學信息管理與信息系（張雪）；溫州醫學院附屬第三醫院ICU（翁海旭）；第二軍醫大學海軍醫學系（馬超群、肖良）

肖良，E-mail：hormat830713@hotmail.com