肺炎支原體肺炎患兒急性期和恢復期血漿H-ficolin和L-ficolin水平分析

南子晴 華春珍 王曉芳 龐福珍

●臨床研究

肺炎支原體肺炎患兒急性期和恢復期血漿H-ficolin和L-ficolin水平分析

南子晴 華春珍 王曉芳 龐福珍

目的 了解肺炎支原體肺炎患兒急性期和恢復期血漿中H-ficolin、L-ficolin水平的變化。方法 采用ELISA法檢測85例肺炎支原體肺炎患兒急性期和恢復期血漿H-ficolin、L-ficolin水平，并進行相關性分析。結果 急性期H-ficolin水平1.8～25.2μg/ml，平均（11.9±5.9）μg/ml，恢復期H-ficolin水平0.3～26.5μg/ml，平均（10.1±5.7）μg/ml，急性期明顯高于恢復期（Z=2.161，P=0.031）。急性期L-ficolin水平0.2～10.6μg/ml，平均（4.5±2.3）μg/ml，恢復期L-ficolin水平0.03～10.2μg/ml，平均（4.6±2.2）μg/ml，急性期和恢復期無統計學差異（t=0.245，P=0.807）。患兒急性期血漿H-ficolin水平與L-ficolin水平明顯相關（r=0.22，P=0.039）。結論 H-ficolin可能參與兒童肺炎支原體肺炎疾病過程。

肺炎支原體 肺炎 兒童 H-ficolin L-ficolin

肺炎支原體（mycoplasma pneumonia，MP）是引起兒童呼吸道感染的常見病原。近年來，肺炎支原體肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）逐漸成為兒童社區獲得性肺炎的重要類型之一，MPP患兒除可有反復咳嗽、發熱等癥狀外，也可伴發心肌炎、腦膜炎、腎炎等多系統的肺外并發癥[1]。研究表明，MPP能引起機體細胞免疫和體液免疫功能紊亂，激活補體系統造成肺內外免疫損傷和炎性損傷[2]。補體系統在體內參與機體抗微生物防御反應，亦介導免疫病理的損傷性反應[3]。已發現糖類模式識別分子Ficolin（包括H-ficolin和L-ficolin）能識別病原體表面的病原相關模式分子并與之結合，激活MBL相關絲氨酸蛋白酶，從而啟動凝集素途徑激活補體系統，因此推測MPP患兒血漿中H-ficolin和L-ficolin可能存在含量的變化。本研究觀測了杭州師范大學附屬醫院兒科住院的85例MPP患兒血漿中H-ficolin和L-ficolin在急性期和恢復期水平的變化，探究其在MPP發病中的可能機制，現報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2012年7月至2013年6月杭州師范大學附屬醫院兒科收治的MPP患兒85例，其中男50例（58.8%），女35例（41.2%），男女比例1.43∶1。年齡11個月～14歲，平均（6.3±3.2）歲，其中0～1歲1例（1.2%），＞1～3歲17例（20.0%），＞3～6歲28例（32.9%），＞6～14歲39例（45.9%）；4歲以上學齡前期和學齡期兒童共67例（78.8%）。所有患兒均有咳嗽癥狀，78例反復發熱，其中高熱62例，中等度發熱13例，低熱3例，熱程1～21（6.7±3.1）d。所有患兒X線胸片均有斑片狀或大片狀密度增高影。

1.2 入選標準 （1）符合中華人民共和國衛生部2012年9月3日發布的衛生行業標準WS382-2012肺炎的診斷；（2）恢復期MP IgG滴度較急性期上升4倍以上；（3）痰液或咽拭子MP-DNA陽性。本研究的恢復期界定為體溫正常，咳嗽癥狀明顯減輕2d后，或X線胸片提示陰影明顯吸收。

1.3 試劑和儀器 人H-ficolin ELISA試劑盒（生產批號：12504K0113-K）和L-ficolin ELISA試劑盒（生產批號：11096K1112-G）為荷蘭Hycult Biotech生物技術公司產品。測定儀器為Molecular device公司的酶標儀。EDTA抗凝管為浙江康是醫療器械有限公司產品。

1.4 方法 所有研究對象于入院時及經治療后恢復期采集靜脈血1.5ml，室溫靜置1h后，2 000×g室溫離心15min，分離血漿，分裝2管，每管200μl，置-70℃冰箱保存待用。檢測時，標本室溫復溫并經漩渦振蕩混勻標本。血漿H-ficolin和L-ficolin檢測采用ELISA法以復孔完成，檢測H-ficolin時樣本以1∶40稀釋，檢測L-ficolin時標本以1∶20稀釋。具體操作如下：按照要求稀釋標準品和樣本，每孔加入100μl，室溫（L-ficolin試劑盒37℃）孵育1h；洗滌4次后每孔加入示蹤劑100μl，室溫孵育1h；洗滌4次后每孔加入100μl鏈酶親和素過氧化物酶，室溫孵育1h，洗滌后每孔加入100μ TMB底物顯色，室溫孵育30min，再在每孔加入100μl終止液中止反應并經酶標儀在450nm波長處讀數，根據標準曲線自動得出待測樣品中H-ficolin和L-ficolin含量。MPP患兒急性期與恢復期抽血時間間隔2～11d，平均（5.5±1.7）d。

1.5 統計學處理 采用SPSS 16.0統計軟件，正態分布計量資料采用表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正態分布計量資料以中位數表示，組間比較采用非參數檢驗（Mann-Whitney檢驗）；相關性分析采用Pearson相關分析法。

2 結果

2.1 臨床治療和結果 所有患兒均治愈出院，住院時間為 4～17（9.3±2.2）d。其中阿奇霉素治愈 80例（94.1%），紅霉素治愈2例（2.4%），阿奇霉素治療效果欠佳，后改紅霉素治療治愈3例（3.5%）。曾采用甲基強的松龍靜脈滴注16例（18.8%），所有患兒均未采用丙種球蛋白注射。

2.2 MPP患兒急性期和恢復期血漿H-ficolin、L-ficolin水平比較 研究總體急性期血漿H-ficolin水平明顯高于恢復期（Z=2.161，P=0.031）；急性期和恢復期男性和女性患兒血漿H-ficolin水平均無統計學差異（Z= 0.335、0.746，均P＞0.05）；研究總體急性期和恢復期血漿L-ficolin水平無統計學差異（t=0.245，P＞0.05）；急性期和恢復期男、女患兒血漿L-ficolin水平均無統計學差異（t=1.081、0.090，均P＞0.05）。

2.3 相關性分析 患兒急性期和恢復期血漿H-ficolin水平與年齡無明顯相關（r=0.158、0.048，P=0.149、0.665）；患兒急性期和恢復期血漿L-ficolin水平與年齡無明顯相關（r=0.105、0.066，P=0.342、0.550）。急性期患兒血漿H-ficolin水平與L-ficolin水平明顯相關（r=0.22，P=0.039），但恢復期兩者之間相關性不明顯（r=0.032，P=0.768）。

3 討論

MPP的發病機制復雜，免疫學機制被認為占有重要的地位。研究表明，MPP患者熱程長，病情重，肺部實變嚴重，伴多系統肺外系統癥狀的患者IgG、IgM、IgA等體液免疫指標上升明顯，提示免疫因素是在MPP發病中起重要作用[4]。本組MPP患兒主要為4歲以上學齡前期和學齡期兒童，即為免疫系統相對完善的兒童，免疫損害也較容易發生。

Ficolin是一組存在于脊椎動物和無脊椎動物體內，組織分布廣泛的凝集素蛋白[5]，最早由Ichijo等[6-7]從豬子宮內膜中作為TGF-β結合蛋白分離出來，與甘露聚糖結合凝集素（mannose binding lectin，MBL）具有類似的結構和功能，有膠原蛋白樣區和纖維蛋白樣區。血漿中的Ficolin可結合病原體表面的糖類配體，通過調理吞噬作用及凝集素途徑激活補體，是天然免疫中的效應分子[8]。已發現，人Ficolin有3種：M-ficolin(又稱ficolin-1，ficolin/p35相關蛋白)、L-ficolin（又稱ficolin-2，p35，Hucolin或EBP-35）和H-ficolin（又稱ficolin-3，Hakata antigen）[9]。前者為主要表達于肺和單核細胞膜表面的相關蛋白，血清中含量很低，而后兩者是血清蛋白，主要存在于血清中[10]。目前國內罕有關于人血清Ficolin水平的研究，本組MPP患兒急性期和恢復期血漿H-ficolin和L-ficolin水平的定量檢測結果，一定程度上反應了兒童中血漿H-ficolin和L-ficolin水平，為今后同類研究提供一定參考。

H-ficolin和L-ficolin均有抗感染功能，其機制主要由兩個方面：一是能識別病原體表面的病原相關模式分子并與之結合激活MBL相關的絲氨酸蛋白酶，進而裂解補體產生C3b、C4b等調理素，以促進吞噬細胞內吞作用；二是直接與吞噬細胞表面的Ficolin特異性受體結合，從而拉近了病原體與吞噬細胞之間的距離，利于病原體被吞噬和清除[8]。H-ficolin主要在肝臟和肺中表達，且在肺中表達大于其他組織，其啟動凝集素途徑能力強于L-ficolin和M-ficolin，并證實H-ficolin具有耐細菌膠原酶的特性[11]。L-ficolin主要在肝臟中表達，與肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌等細菌結合活性較強[12]，在體內外能結合糖蛋白、血凝素和神經氨酸酶，能抑制流感病毒[13]。本組為MPP患兒，急性期血漿H-ficolin水平顯著高于恢復期，考慮與MPP患兒組織炎性損傷主要限于肺部有關，MP感染肺部可能刺激了H-ficolin的表達從而利于病原體被調理吞噬而清除，至于是否通過與MBL相關絲氨酸蛋白酶激活補體，有待體外結合活性鑒定及補體凝集素途徑關鍵組成研究以明確機制。此外，本研究中有16例患兒用過甲基強的松龍，可能對ficolin的表達有一定影響。在激活補體的凝集素組分中，H-ficolin是最有效的補體活化劑，而L-ficolin和MBL激活補體的能力只有H-ficolin的一半[14]，本組L-ficolin在血漿中表達穩定，在MPP患兒急性期和恢復期無明顯差異，可能與L-ficolin和MP結合活性低或受H-ficolin觸發的補體激活中間產物抑制而不能充分誘導補體激活有關，該推測也有待進一步研究證實。

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（本文編輯：沈昱平）

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本刊編輯部

Serum H-ficolin and L-ficolin levels in children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia

NAN Ziqing，HUA Chunzhen，WANG Xiaofang，et al.Department of Pediatrics，the Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University，Hangzhou 310015,China

Objective To determine serum H-ficolin and L-ficolin levels in children with Mycoplasma pneumoniae pneumonia(MPP). Methods The levels of serum H-ficolin and L-ficolin at acute and convalescent stages were determined by ELISA in 85 children with MPP. Results The mean H-ficolin level at the acute stage was (11.9±5.9)μg/ml(1.8～25.2μg/ml), which was significant higher than that at the convalescent stage(10.1±5.7)μg/ml(0.3～26.5μg/ml,Z=2.161,P=0.031).The mean L-ficolin levels at the acute stage and convalescent stage was (4.5±2.3)μg/ml(0.2～10.6μg/ml)and (4.6±2.2)μg/ml (0.03～10.2μg/ml),respectively(t=0.245,P=0.807).In acute stage serum H-ficolin level was correlated with L-ficolin level(r=0.22, P=0.039). Conclusion H-ficolin may be involved in the disease process in Mycoplasma pneumonia in children.

Mycoplasma pneumonia Pneumonia Children H-ficolin L-ficolin

2014-06-04）

浙江省醫藥衛生科技計劃項目（2011KY A128）；杭州市醫藥衛生科技計劃項目（2011A020）

310015 杭州師范大學附屬醫院兒科（南子晴、華春珍、王曉芳，華春珍現在浙江大學醫學院附屬兒童醫院工作）；天臺縣人民醫院兒科（龐福珍）

華春珍，E-m ai l：chunzhenhua@yahoo.com