靶向survivin shRNA在腫瘤治療中的研究進展

張　鑫　郝玉琴

·綜述·

靶向survivin shRNA在腫瘤治療中的研究進展

張鑫郝玉琴

生存素在細胞凋亡抑制中起重要作用，越來越多的研究者將其作為腫瘤基因治療的理想靶點。應用RNA干擾技術靶向抑制生存素的表達，從而抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤血管生成、增強腫瘤細胞對放化療的敏感性。

生存素； shRNA； 腫瘤

生存素（survivin）是凋亡抑制基因家族中分子量最小而抗凋亡作用最強的成員，在正常成人組織很少表達，而在各種惡性腫瘤中高度表達，生存素具有抑制細胞凋亡，參與細胞周期調控，促進細胞分裂增殖，促進血管增生等多種生物學功能。生存素在腫瘤組織中的特異性表達和功能，使其成為腫瘤研究的新靶點。RNA干擾技術是一項高特異性和高效率的基因沉默技術，在腫瘤相關基因的功能研究和基因治療方面具有廣闊的應用前景。

1　生存素概述

生存素是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族成員之一，位于染色體17q25，全長14.7kb包含4個外顯子和3個內含子，是分子量最小但抗凋亡活性最強的成員。生存素蛋白分子量很小，氨基酸末端僅包含有一個含有半胱氨酸、組氨酸的桿狀病毒lAP重復（baculoviral IAP repeat，BIR）序列，其在抑制細胞的凋亡方面起重要作用［1］。生存素的表達具有特異性，主要表達于人的胚胎組織和各種腫瘤組織。生存素表達與IAPs家族其他成員的最大區別就是其除子宮內膜、胎盤組織和胸腺組織中存在不同程度表達外，在其他大多數組織不表達，而其余的lAPs則能夠廣泛表達于正常成人組織中［2］。由此可見，生存素的表達分布具有明顯的組織細胞選擇性，即主要表達于胚胎及未分化成熟的組織中。生存素的表達具有細胞周期依賴性，主要表現為只在細胞有絲分裂的G2/M期表達，G1期幾乎不表達，在有絲分裂G2/M期，生存素可與有絲分裂紡錘體的微管特異性結合，調節細胞有絲分裂［3］。生存素在癌細胞中的過度表達可能促進其跳過細胞周期檢查點通過有絲分裂而促進癌細胞分裂增殖［4］。由于生存素啟動子在正常組織細胞中基本靜止，而在腫瘤組織細胞中過度表達，所以其被公認為是腫瘤相關基因［5］。研究發現生存素具有抑制細胞凋亡，參與細胞周期調控，促進細胞分裂增殖，促進血管增生等多種生物學功能［6，7］。

2　RNA干擾技術作用機制及應用

2.1RNA干擾機制 當外源性基因隨機整合到細胞進行轉錄時，常會產生一些雙鏈RNA（double strands RNA，dsRNA）。宿主細胞胞質中的核酸內切酶（Dicer）將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段即RNA干擾相關效應分子（small interfering RNA，siRNA）。siRNA在細胞內RNA解旋酶的作用下解鏈成正義鏈和反義鏈，反義siRNA再與體內一些酶（包括內切酶、外切酶、解旋酶等）結合形成 RNA誘導的沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC），RISC與外源性基因表達的mRNA的同源區進行特異性結合。具有核酸酶的功能RISC，在結合部位切割mRNA，切割位點即是與siRNA中反義鏈互補結合的兩端，被切割后的斷裂mRNA隨即降解，導致了該mRNA轉錄的蛋白質無法合成，出現了該mRNA轉錄的基因不能表達的現象即基因沉默現象［8］。

2.2RNA干擾技術的應用 RNA干擾技術是先確定靶基因的結構，利用dsRNA進入細胞后特異性降解細胞內同源信使RNA（mRNA），從而阻斷特定基因表達，其作用相當于基因敲除。目前RNA干擾的方法最常用的就是直接轉染siRNA和構建shRNA載體。但是化學合成siRNA成本大且作用時間短，使其應用受到限制。

shRNA是一段具有緊密發卡環的RNA序列，通過載體將克隆其編碼的DNA導入細胞，在細胞中，shRNA被加工成siRNA，發揮抑制特異mRNA表達的作用，這種裝載了shRNA的載體可以通過篩選，穩定傳遞到子代細胞中去［9］。載體介導shRNA表達技術能長期和穩定地抑制靶基因的表達，因此可用來構建理想的實驗細胞模型，與化學合成siRNA法相比具有更大的應用潛力，因此shRNA表達載體技術成為腫瘤基因治療的強大工具。

3　靶向survivin-shRNA在腫瘤治療中的作用機制

靶向survivin-shRNA在腫瘤治療中具有多重作用，可以促進腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞分裂增殖，抑制腫瘤血管生成及增加放化療等敏感性。

3.1抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡 Gou等［10］通過建立survivin-shRNA慢病毒載體轉染膀胱癌T24細胞和BJ細胞，用流式細胞術（FCM）來評估膀胱癌細胞的凋亡情況，結果顯示大多數T24細胞和BJ細胞在G2/M期被阻滯，顯著抑制了T24細胞和BJ細胞的增殖，促進了腫瘤細胞凋亡。

Zhen等［11］構建了靶向survivin-shRNA載體并轉染神經膠質瘤U251細胞，體外實驗將對數生長期的細胞接種于24孔板，連續7天收集，用Coulter計數器測定細胞數，并繪制生長曲線。結果顯示7天后實驗組U251-SR細胞比對照組減少（72.0±4.0）%。菌落形成實驗將細胞接種到六孔板，培養12天后甲醇固定吉姆薩染色，實驗組U251-SR菌落形成率明顯低于對照組。FCM分析顯示G1期細胞增加，S期細胞減少，且U251-SR組異常細胞較對照組明顯增加，細胞有絲分裂發生障礙，凋亡較對照組明顯增加。該作者通過建立U251裸鼠移植瘤模型，用survivin-shRNA進行干預，定期觀察并測量腫瘤大小，3周后U251 -SR組腫瘤體積和重量均明顯低于對照組。

Xing等［12］用靶向survivin-shRNA質粒轉染卵巢癌SKOV3細胞，FCM分析結果顯示，survivin-shRNA 組G1/G2期細胞數增多、S期細胞數減少，透視顯微鏡（TEM）及TUNEL染色結果顯示靶向survivin-shRNA促進了腫瘤細胞凋亡、抑制了腫瘤細胞增殖。

Liu等［13］用surviving-shRNA質粒轉染前列腺癌DU145細胞，FCM分析結果顯示：實驗組Psi-svv細胞凋亡數為（10.31±1.23）%，對照組細胞凋亡數為（1.89±0.16）%，明顯促進了前列腺癌細胞凋亡。該作者通過建立前列腺癌裸鼠移植瘤，并用survivinshRNA干預，70天后處死裸鼠，測量腫瘤的重量和體積。結果顯示：實驗組salmonella-psi-svv腫瘤重量為（2.04±0.71）g、腫瘤體積為（671.36±165.11）mm3，對照組腫瘤重量為（6.72±1.53）g、腫瘤體積為（4897.41±1289.37）mm3，可以看出靶向survivin-shRNA明顯的抑制了腫瘤組織的生長。

Zhang等［14］用survivin-shRNA干擾肝癌細胞生長實驗中，MTT結果顯示survivin-shRNA可以明顯抑制腫瘤細胞的生長和集落形成。FCM分析結果顯示實驗組G1期細胞比列增高，G2/M期相應減少，說明survivin-shRNA可引起細胞有絲分裂障礙，使腫瘤細胞凋亡敏感性增加。該作者將survivin-shRNA腺病毒注射入裸鼠肝癌組織內，觀察腫瘤生長情況，結果顯示靶向survivin-shRNA抑制了腫瘤組織的生長。

還有學者通過研究發現，通過對生存素基因的RNA干擾，能使人類宮頸癌細胞、腦膠質瘤細胞及乳腺癌細胞凋亡率顯著增高，增殖速度明顯減低［15］。腫瘤細胞的無限制增殖與腫瘤的發生和發展密切相關，因此抑制腫瘤細胞增殖并促進其凋亡是腫瘤治療的主要目的。國內外學者的研究結果充分說明了靶向survivin-shRNA可以抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞的凋亡，從而達到抑制腫瘤生長的作用。

3.2抑制腫瘤血管形成 Zhen等［11］通過建立U251裸鼠移植瘤模型，用survivin-shRNA進行干預，研究發現，實驗組與對照組相比腫瘤細胞增殖指數（proliferation index，PI）和微血管密度（microvessel density，MVD）明顯下降，可以看出靶向survivin-shRNA明顯抑制了腫瘤血管形成。

Zhang等［16］將構建好的survivin-shRNA質粒轉染胃癌細胞SGC-7901，定量聚合酶鏈反應（Quantitative polymerase chain reaction，qPCR）及蛋白印跡（Western blot）分析顯示血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）mRNA水平與survivin mRNA水平呈正相關，當survivin表達下調時VEGF-C表達也下調。結果表明VEGF-C的表達水平受生存素影響，由此可見靶向survivin-shRNA可以抑制腫瘤血管形成。

3.3增加腫瘤對放化療及藥物治療的敏感性 Hu等［17］通過shRNA下調生存素的表達來觀察喉鱗癌細胞對放療的敏感性，實驗通過對荷瘤小鼠進行放療治療，每隔4天測量一次腫瘤體積，結果顯示survivin-shRNA組腫瘤體積明顯小于對照組。這表明靶向survivin的shRNA明顯提高了腫瘤細胞對放療的敏感性。通過shRNA下調survivin來提高喉癌放療敏感性的同時也可以減少放療對正常組織的損失，對喉癌的治療有重大意義。

雖然急性淋巴細胞白血病（ALL）總體預后較過去幾十年有所改進，但ALL的耐藥性復發仍然是一個亟待解決的問題。Park等［18］通過靶向survivinshRNA來抑制ALL的耐藥實驗顯示，對照組化療藥物長春新堿（vincristine，V）誘導腫瘤細胞凋亡50%的濃度（IC50）是實驗組survivin-shRNA的7.5倍。實驗通過靶向survivin-shRNA明顯提高了其對化療的敏感性，這對ALL的治療具有潛在的應用價值。

Xue等［19］構建攜帶靶向 survivin基因的 shRNA質粒載體，脂質體法轉染人卵巢癌細胞株sKOV3和H08910，FCM及MTT結果顯示suvivin-shRNA與大黃素聯合應用組細胞的增殖率低于單藥應用組，凋亡率高于單藥應用組。這一結果充分說明轉染suvivinshRNA后可以明顯提高卵巢癌sKOV3和H08910細胞對大黃素治療的敏感性。

4　小結

RNA干擾技術具有高效率、高特異性、抑制作用迅速、操作簡單、設備依賴性低等優點。生存素靶向治療可以促進腫瘤細胞凋亡并抑制其增殖，而對正常組織幾乎沒有不良影響，這是靶向治療所特有的優點［20］。RNA干擾在腫瘤治療方面表現出其他治療方案無法比擬的優勢。RNA干擾技術常用的載體有病毒載體和非病毒載體，由于病毒載體具有易于制備、宿主細胞范圍廣、轉染效率高、理化性質穩定等優點，因此成為基因治療研究中應用最為廣泛的載體，但對于病毒載體的安全性有待進一步研究。

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（收稿：2015-04-07）

Update of shRNA targeting survivin in the treatment of tumor

ZHANG Xin，HAO Yuqin.
Department of Dermatology，Third Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University，Baotou 014010，China
Corresponding author：HAO Yuqin，E-mail：haoyuqin0472@163.com

［Abstract］Survivin plays an important role in the inhibitor of apoptosis，which is considered as an ideal target for tumor treatment by more and more researchers.shRNA interference technique is targeted on the inhabiting the expression of survivin，so that inhibiting the proliferation of tumor cells，inducing the apoptosis of tumor cells，inhibiting the angiogenesis of tumor and enhancing the sensitivity of tumor cells to radiotherapy and chemotherapy.

surviving；shRNA；tumor

國家自然科學基金資助項目（編號：81260407）

內蒙古醫科大學第三附屬醫院（內蒙古包鋼醫院），包頭，014010

郝玉琴，E-mail：haoyuqin0472@163.com