過敏性休克動物實驗模型的進展

陳潔 謝華

●綜 述

過敏性休克動物實驗模型的進展

陳潔 謝華

過敏性休克，亦稱變態反應性休克，是指外界某些特異性變應原作用于已致敏的機體，引發全身性速發型變態反應；以急性呼吸及循環衰竭表現為主，可在短時間內累及多個臟器，甚至休克、死亡。過敏性休克發生突然，病情嚴重，若不及時處理?？晌＜吧?，是所有過敏反應中發病最急、病情最嚴重的一種。因其突發性和不可預測性，無法進行人體大樣本、隨機、雙盲對照研究，同時該病治療藥物的開發進展緩慢，到目前為止腎上腺素仍然是治療的首選藥物[1-2]，激素和抗組胺藥的效果和應用時機存在爭議[2-3]。因此，過敏性休克動物實驗模型是我們研究過敏性休克發病機制及探討有效治療手段的主要方式，國內外學者已經建立了豚鼠、小鼠、大鼠和家兔等不同種屬的動物實驗模型，本文就近年來國內主要4種過敏性休克動物實驗模型的進展作一綜述，以期為相關研究的開展提供參考。

1 大鼠過敏性休克模型

近年來，建立大鼠過敏性休克模型的方法主要有2種：（1）以卵蛋白為過敏原腹腔注射致敏，尾靜脈注射誘發過敏性休克；（2）以腹腔注射肥大細胞脫顆粒劑化合物48/80的方法直接誘發大鼠過敏性休克，主要用于藥物及其成分的研究。

景麗霞等[4]以卵蛋白為過敏原建立過敏性休克大鼠模型，研究CD63表達在過敏性休克診斷中的應用價值，亦通過研究CD63表達來確定嗜堿性粒細胞活化。建模步驟如下：（1）實驗開始以5%雞卵清蛋白0.5ml和4%氫氧化鋁佐劑0.2ml腹腔注射，致敏18d后通過尾靜脈注射10%雞卵清蛋白1ml誘發大鼠過敏性休克的發生。通過觀察動物臨床癥狀與尸體解剖結果來證明過敏性休克大鼠模型建立成功，實驗組大鼠死亡率為25%，對照組為0%。該法操作簡便，試劑獲取容易，但大鼠休克死亡率低，實驗動物浪費較大，因此，后期學者針對以上不足進行了改進，通過增加刺激次數來提高誘發過敏性休克的成功率。米麗等[5]在過敏性休克死亡后大鼠血清IgE、類胰蛋白酶的變化規律與死亡時間、尸體及樣本保持環境的相關性研究中，通過多次腹腔注射過敏原增強免疫，提高了大鼠過敏性休克死亡率。實驗過程如下：按體重給予過敏原，每100g體重給予10mg卵蛋白（溶于0.5ml生理鹽水，氫氧化鋁佐劑1∶1混合），分別于第1、3、5天腹腔注射給藥1次/d，以增強免疫，第18天尾靜脈注射10%卵蛋白1ml誘發。通過觀察大鼠臨床癥狀、尸體解剖組織形態學改變、肺組織甲苯胺藍染色見肥大細胞脫顆粒等來證明過敏性休克大鼠實驗模型建立成功，死亡率為71%，明顯高于景麗霞等[4]建模結果，提示大鼠模型改良成功，低濃度、多次致敏期注射能有效提高模型死亡率。

以肥大細胞脫顆粒劑化合物48/80誘導的大鼠過敏性休克模型是另一建模方法，是近年來研究藥物及其成分的常用造模方法。李曉潔等[6]通過建立以肥大細胞脫顆粒劑化合物48/80誘導的大鼠過敏性休克模型，檢測VCAM-1在過敏性休克大鼠各器官中的表達及其變化，探討VCAM-1在過敏性休克大鼠器官中的作用及表達規律。建模步驟如下：將化合物48/80稀釋成質量濃度為0.5mg/ml的注射液，休克組每只大鼠腹腔注射4ml，建立過敏性休克動物模型。通過觀察大鼠臨床癥狀、尸體解剖、肺組織HE染色來證明建模成功，死亡率為100%。

此外，大鼠過敏性休克模型還以青霉噻唑蛋白作為過敏原致敏的建立方法，近年來較少采用。

2 豚鼠過敏性休克模型

豚鼠呼吸系統的免疫敏感性與人類相近，且豚鼠易于致敏，其過敏性休克模型在近年來采用較多，多人混合血清是豚鼠過敏性休克模型應用較為普遍的致敏原。該法完整的模型制備過程由任廣睦等[7]首次報道，具體如下：以無菌生理鹽水稀釋后的多人混合血清作為過敏原注射液（1∶10），在豚鼠右側后爪掌皮內注射0.15ml過敏原，致敏3周后心腔穿刺注入過敏原1ml來誘發過敏性休克。該法制備過敏原注射液過程簡單，獲取途徑較多，且對經費要求不高，國內學者采用較多。王昌亮等[8]亦通過上述方法復制豚鼠過敏性休克模型。應用免疫組化染色、圖像分析技術觀察豚鼠過敏性休克死亡肺組織中類胰蛋白酶和胃促胰酶的表達情況；結果表明實驗組肺組織中類胰蛋白酶和胃促胰酶陽性細胞明顯增多，冷藏48h和冷凍7d對以上2種酶的表達無明顯影響，可作為過敏性休克死亡的診斷依據。

該模型的建立對實驗者心腔注射操作技術要求較高；此外，心腔注射的方式會增大豚鼠發生心臟壓塞死亡的可能性，影響實驗觀察、動物過敏性休克死亡的發生率和結果的可信度。心腔穿刺對心肌損傷較大，而心肌組織內存有較多肥大細胞，心肌創傷后肥大細胞釋放大量類胰蛋白酶入血，會影響相關實驗血液類胰蛋白酶表達水平的測量結果。陳炯垣等[9]基于原實驗存在的不足，進行了以多人混合血清為過敏原的豚鼠過敏性休克模型改良。改良模型的致敏原分為2種：致敏為1∶2稀釋的混合人血清，誘發稀釋比例為1∶20。致敏過程亦有所改變：分別于第1、3天在豚鼠雙側后爪掌皮內注射0.1ml過敏原稀釋液（1∶2）；致敏后2周豚鼠后腿足背靜脈穿刺注入1 ml過敏原稀釋液（1∶20），誘發過敏性休克。結果提示改良模型的過敏反應死亡率明顯提高，且豚鼠無心臟壓塞現象，改良模型組血清中總 IgE和肥大細胞類胰蛋白酶含量均較對照組明顯升高，差異有統計學意義；亦高于任廣睦等[7]報道的方法。改良模型為研究血清總IgE、肥大細胞類胰蛋白提供了有效的實驗動物模型，并受到國內學者的歡迎[10]。

近年來有報道以卵蛋白、生理鹽水配制成的卵蛋白溶液為過敏原腹腔注射建立豚鼠過敏性休克動物模型。楊凱等[11]采用卵蛋白腹腔注射誘導豚鼠過敏性休克模型，觀察白三烯E4、前列腺素D2、羧肽酶A3和血小板活化因子在過敏性休克死亡豚鼠體內的變化規律。建模步驟如下：將卵蛋白、生理鹽水配制成2%卵蛋白溶液，將卵蛋白溶液與等體積弗氏完全佐劑充分混合成乳劑，在豚鼠左右后足掌內皮下各注射0.2ml乳劑，致敏后2周腹腔注射2%卵蛋白溶液2ml，建立豚鼠過敏性休克動物模型。通過觀察動物臨床癥狀及解剖后各組織器官改變來證明過敏性休克模型建立成功。

此外，國內外學者還建立了許多相關動物模型，但近年來均較少采用，如以天花粉蛋白注射液為過敏原腹腔注射致豚鼠全身過敏反應，以青霉噻唑蛋白致敏來誘發豚鼠過敏性休克。

3 小鼠過敏性休克模型

近年來，采用昆明種小鼠建立過敏性休克模型由薛少華等[12]首次提出。昆明種小鼠價格低廉，容易獲得，操作簡便，且可成批處理。該法以卵蛋白為過敏原建立小鼠過敏性休克模型，具體步驟如下：第1天腹腔注射卵蛋白0.25ml，1周后加強注射一次，免疫后第3周，尾靜脈注射卵蛋白0.5ml，以誘發過敏性休克。通過觀察誘發后動物臨床癥狀、HE染色結果、肥大細胞脫顆粒計數結果等來證明模型建立成功，死亡率為22.5%。該法操作簡單，資金要求低，可操作性強，近年來有較多學者開始采用[13]。

4 家兔過敏性休克模型

目前常見的家兔過敏性休克模型主要以多人混合血清為過敏原。程紅霞等[14]通過建立家兔過敏性休克模型觀察P物質在過敏性休克家兔胃腸道組織中隨時間變化的規律，探討其在過敏性休克中的作用。實驗步驟如下：家兔皮下注射20%多人混合血清1ml，每隔1周加注一次，致敏3周后在耳緣靜脈快速注入制備好的50%多人混合血清5ml，以誘發過敏性休克。通過觀察實驗動物臨床癥狀、尸體解剖和HE染色結果來證明實驗模型建立成功，動物死亡率達70%。該法是建立家兔過敏性休克模型的經典方法，已被多位學者采用[15]。

5 結論

為了探索診斷過敏性休克的敏感、客觀指標以及開發治療過敏性休克的藥物，國內外學者建立了許多相關動物模型。制備過敏性休克模型的動物有很多種，豚鼠、家兔、大鼠、小鼠、貓、狗、牛、馬、羊、豬和雞等動物均可，其中豚鼠是目前過敏性休克和變態反應實驗研究的首選動物。豚鼠繁殖周期短、易飼養，注入微量過敏原即可致敏，致敏后2～3周處于高敏狀態且可維持6個月以上，其速發型變態反應與人相似，是免疫學研究方面首選的動物過敏反應模型。豚鼠過敏性休克模型是過敏性休克研究中的經典模型。但是，豚鼠價格昂貴，且受到商品化試劑的局限性，豚鼠過敏性休克模型的應用受到一定限制。小鼠和大鼠具有繁殖快、價格低、來源豐富、有關分子生物學試劑較多等優點，近年來已成為研究速發型過敏反應機制和IgE抗體應答的主要實驗動物。但是，小鼠和大鼠也存在體積小、體重輕、操作不便等問題，因此，家兔逐漸進入研究者的視野。家兔體積大，性情溫順，易繁殖、飼養，耳靜脈大而清晰、易進行抽血或注射，常被用來制備各種免疫血清或進行過敏反應的研究。

綜上所述，用于建立過敏性休克模型的動物種類繁多，應根據實驗目的、方法、資金、參與人員等因素綜合考慮，選擇適合建模的動物。在醫療行為中，過敏性休克沒有診斷的“金標準”，學者通過動物實驗進行臨床癥狀觀察、尸體解剖、組織染色、肥大細胞脫顆粒觀察計數和血清IgE檢測等進行診斷。本文總結國內普遍采用的過敏性休克動物模型，介紹其建模方法，旨在為從事相關研究的醫學人員提供參考。

[1] Simons F E．Pharmacologic treatment of anaphylaxis:can the evidence base be strengthened[J]．Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2010,10(4):384-393．

[2] Ring J,Grosber M,Mo hrenschlager M,et al．Anaphylaxis:acute treatment and management[J]．Chem Immunol Allergy,2010,95: 201-210．

[3] Choo K J,Simons E,Sheikh A．Glucocorticoids for the treatment of anaphylaxis:Cochrane systematic review[J]．Allergy,2010,65(10): 1205-1211．

[4] 景麗霞,郭相杰,靳茜茜,等．過敏性休克大鼠血嗜堿性粒細胞CD63的表達[J]．法醫學雜志,2012,28(3):172-174,178．

[5] 米麗,高衛民,杜中波,等．大鼠過敏性休克死后血清IgE、類胰蛋白酶的變化[J]．法醫學雜志,2015,31(3):181-184．

[6] 李曉潔,郭相杰,高彩榮．血管細胞黏附分子-1在過敏性休克大鼠器官中的表達[J]．法醫學雜志,2011,27(2):87-89,90．

[7] 任廣睦,白吉偉,高彩榮,等．混合人血清誘發豚鼠過敏性休克猝死模型的建立[J]．法醫學雜志,2005,21(3):169-170．

[8] 王昌亮,張國華,吳旭,等．豚鼠過敏性休克肺組織中類胰蛋白酶和胃促胰酶的表達[J]．中國法醫學雜志,2010,25(4):236-239．

[9] 陳炯垣,賴躍,李冬日,等．混合人血清誘發豚鼠過敏反應死亡模型的改良[J]．法醫學雜志,2012,28(6):408-412．

[10] 喻永敏,趙振賓,馬智華,等．胃促胰酶和肥大細胞在豚鼠過敏性休克死亡的應用[J]．現代生物醫學進展,2015,15(17):3223-3227．

[11] 楊凱,郭相杰,閆學斌,等．前列腺素D2、羧肽酶A3和血小板活化因子在過敏性休克豚鼠體內含量變化 [J]．法醫學雜志,2012,28(3): 175-178．

[12] 薛少華,高彩榮．卵蛋白誘發小鼠過敏性休克模型的建立[J]．刑事技術,2009,4:7-8．

[13] 肖海,韓巧秀,楊慶春．胱硫醚-γ-裂解酶在過敏性休克小鼠肺組織中的表達[J]．贛南醫學院學報,2014,34(1):5-7．

[14] 程紅霞,李斌,高彩榮,等．P物質在過敏性休克家兔胃腸道內的表達[J]．中國法醫學雜志,2010,25(4):245-248．

[15] 唐田豐,靳茜茜,郭相杰,等．家兔過敏性休克模型的建立和血清IgE含量測定[J]．山西醫藥雜志,2013,42(3):264-265．

2015-10-14）

（本文編輯：陳丹）

遼寧省自然科學基金項目（201202244）

110016 沈陽軍區總醫院呼吸與變態反應疾病診治中心（陳潔、謝華，陳潔系大連醫科大學全日制研究生）

謝華，E-mail：13309885483@163.com