重癥監護病房耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌同源性分析

潘慧瓊, 袁雪峰, 周　敏, 厲曉玲, 李露池

(長沙市第一醫院, 湖南 長沙　410005)

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重癥監護病房耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌同源性分析

潘慧瓊, 袁雪峰, 周敏, 厲曉玲, 李露池

(長沙市第一醫院, 湖南 長沙410005)

[摘要]目的了解重癥監護病房(ICU)分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的藥敏結果及同源性。方法對2014年4—5月某院ICU患者和環境分離的11株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進行藥敏試驗，以及采用隨機擴增多態性DNA(RAPD)擴增法進行同源性分析。結果11株肺炎克雷伯菌8株分離自患者，3株分離自環境，標本分布以痰為主(6株，占54.55%)。藥敏試驗結果顯示：10株(90.91%)對環丙沙星耐藥；11株對復方磺胺甲口惡唑均敏感，對亞胺培南均為中介，對其余抗菌藥物耐藥率均為100%。11株肺炎克雷伯菌均有3個條帶，可以分為2型：Ⅰ型10株(1～5號、7～11號菌株)，Ⅱ型1株(6號菌株)。結論醫院ICU肺炎克雷伯菌耐藥嚴重，ICU患者和環境分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌為同一克隆株。加強ICU環境清潔、消毒及監測，有利于減少和及時預警多重耐藥菌，降低醫院感染。

[關鍵詞]肺炎克雷伯菌; 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌; 同源性; 重癥監護病房; 醫院感染

[Chin Infect Control，2015，14(12)：827-829]

醫院重癥監護病房(intensive care unit,ICU)是救治危重患者的場所，患者常進行各種侵入性操作，接受大量抗菌藥物治療，伴有嚴重基礎疾病，免疫功能低下，常導致醫院感染的發生，成為多重耐藥菌產生和傳播的高發區域。肺炎克雷伯菌是最常見的醫院感染病原菌，可引起下呼吸道、泌尿生殖道、血液、傷口及顱內等部位感染。隨著碳青霉烯類抗生素的大量使用，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌逐漸增多[1]，已成為全球性問題，ICU多重耐藥菌管理面臨著嚴峻挑戰。本研究對某一時間段內某院ICU患者和環境分離的11株肺炎克雷伯菌進行藥敏檢測和同源性分析，探討多重耐藥菌感染患者病房環境消毒和環境監測的必要性。

1材料與方法

1.1菌株來源收集2014年4—5月某院ICU患者和環境分離的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌。

1.2儀器與試劑主要包括Vitek-32型全自動微生物分析儀及配套鑒定卡(法國生物梅里埃公司)、Real-Time PCR(美國Applied Biosystems)、DYY-ll型電泳儀(北京君意東方設備有限公司)、數碼凝膠圖像分析系統(上海天能科技有限公司)、DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)、瓊脂糖(GENE COMPANY LED)。

1.3菌株鑒定及藥敏試驗細菌鑒定采用法國生物梅里埃公司ATB細菌鑒定儀和相應的鑒定卡。抗菌藥物敏感試驗為微量肉湯法，按美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2012年版標準操作及判斷結果，抗菌藥物包括哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、替卡西林/克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢拉啶、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢西丁、亞胺培南、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、奈替米星、環丙沙星、復方磺胺甲口惡唑。

1.4同源性分析DNA的提取：取-20℃保存的肺炎克雷伯菌菌種接種于血平板，轉種3次，挑取單個菌落接種于肉湯培養基。取3 mL培養液，離心后采用緩沖液和蛋白酶K處理，吸附柱進行過濾，用洗脫液對吸附柱進行洗脫，12 000 r/min離心3 min，提取DNA置-20℃保存。基因同源性分析：采用隨機擴增多態性DNA(RAPD)擴增DNA模板,引物序列為(5’-3’):5-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3[2]，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。總反應體系25 μL：7.5 μL滅菌雙蒸水，12.5 μL 2×Master MIX，2 μL引物ERIC 2，模板3 μL。RAPD反應條件[2]：94℃預變性1 min，94℃變性1 min，36℃退火1 min，72℃延伸2 min，共35個循環，72℃最后延伸5 min。將RAPD產物置于2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳；每孔加DNA產物7 μL。電泳條件為電壓70 V，電流60 mA，時間120 min。

1.5DNA同源性判定標準DNA條帶位置完全相同者，為同一型；相差一條者，密切相關，為亞型；不滿足上述條件者為不同基因型[2]。

2結果

2.1一般資料2014年4—5月該院ICU共檢出耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌11株，其中8株來源于ICU患者送檢標本， 3株來源于ICU環境采樣。標本分布為痰(6株)，清潔后呼吸機出口(2株)，血、分泌物、呼吸機面板各1株。

2.2藥敏結果11株肺炎克雷伯菌對哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林、阿莫西林/克拉維酸、替卡西林/克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢拉啶、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢吡肟、頭孢西丁、美羅培南、阿米卡星、慶大霉素、妥布霉素、奈替米星均100%耐藥；對復方磺胺甲口惡唑均敏感,對亞胺培南均為中介。10株對環丙沙星耐藥，耐藥率90.91%。

2.3細菌同源性鑒定電泳結果顯示，11株肺炎克雷伯菌均有3個條帶，可以分為2型：Ⅰ型10株(1～5號、7～11號菌株)，Ⅱ型1株(6號菌株)。見圖1。

M: marker;1—11泳道：11株碳青霉烯類肺炎克雷伯菌標本;N:陰性對照

圖1 耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌RAPD電泳圖

Figure 1RAPD electrophoresis map of CRKP

3討論

肺炎克雷伯菌作為一種條件致病菌所導致的感染在細菌感染學疾病中的所占比重日漸增加，Amazian等[3]對地中海地區27所醫院調查顯示，肺炎克雷伯菌占醫院感染的9.20%；我國肺炎克雷伯菌是醫院感染的主要致病菌之一，占9.03%[4]。隨著β-內酰胺類、喹諾酮類、氨基糖苷類和碳青霉烯類等抗菌藥物的廣泛使用，多重耐藥菌迅速出現，多重耐藥菌的分離率逐年上升。同一克隆株在醫院內的播散容易導致多重耐藥菌的暴發流行，國外曾報道一起因多重耐藥肺炎克雷伯菌引起的醫院感染暴發流行，感染患者病死率高達40%[5]。

預防與控制多重耐藥菌的傳播和流行是迫切需要解決的問題。菌株基因同源性分析對醫院感染暴發流行的來源，以及傳播途徑的追蹤具有重要意義。常用的同源性分析方法有質粒指紋圖譜分析、限制性核酸內切酶分析、RAPD、脈沖場凝膠電泳(PFGE)、重復序列分析[6-7]。RAPD具有快速、簡便、經濟的特點，有助于查找醫院感染源，切斷感染途徑，是一種值得推廣的方法。

本研究藥敏試驗結果顯示，11株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥譜基本相同，對大部分抗菌藥物均耐藥，說明醫院ICU肺炎克雷伯菌耐藥嚴重，藥敏結果相同表明菌株可能來自同一個克隆株。基因同源性分析顯示，除6號痰標本分離株外，其余7株臨床分離株與3株環境標本分離株基因型相同，證實10株菌均來自同一克隆菌株。藥敏和基因分析結果表明，肺炎克雷伯菌能從患者擴散到周圍環境，并且在環境中存活，潛在可能通過環境途徑進行傳播，導致肺炎克雷伯菌在ICU內傳播。因此，有必要加強對環境的清潔與消毒，減少環境中多重耐藥菌；定期對環境衛生進行采樣分析，對環境消毒效果進行評價；對多重耐藥菌的暴發進行預警，有效降低多重耐藥菌在ICU內的傳播。研究[8]報道，加強環境監測，使其衛生清潔質量保持在較高水平，可有效防控ICU多重耐藥菌醫院感染，降低醫院感染發病率。

多重耐藥菌感染增加患者疾病的治療難度，影響搶救成功率和預后。環境因素作為外源性危險因素應重點控制，通過對環境進行及時的清潔與消毒，有效避免了因交叉感染造成的耐藥菌株傳播，對遏止醫院感染的蔓延能發揮重要作用。通過采取有效的消毒隔離措施，可最大程度減少醫院感染的發生。常規環境衛生學檢測是對消毒效果的監測，針對性檢測是有重點的過程監控，有利于找出工作中的薄弱環節或存在的隱患，是防止醫院感染暴發流行有效的監測方式。

[參 考 文 獻]

[1]肖素香.外科重癥監護病房醫院感染原因分析及預防對策[J].中華醫院感染學雜志, 2008, 18(2):178-180.

[2]Bou G, Cerveró G, Domínguez MA,et al. Characterization of a nosocomial outbreak caused by a multiresistantAcinetobacterbaumanniistrain with a carbapenem-hydrolyzing enzyme; high-level carbapenem resistance inA.baumanniiis not due solely to the presence of beta-lactamases[J].J Clin Microbiol, 2000, 38: 3299-3305.

[3]Amazian K, Rossello J, Castella A, et al. Prevalence of nosocomial infections in 27 hospitals in the Mediterranean region[J]. East Mediterr Health, 2010, 16(10)：1070-1078.

[4]文細毛, 任南, 吳安華, 等.全國醫院感染監控網醫院感染病原菌分布及變化趨勢[J].中華醫院感染學雜志, 2011, 21(2):350-355.

[5]Lithgow AE, Kilalang C. Outbreak of nosocomial sepsis in the Special Care Nursery at Port Moreshy General Hospital due to multiresistantKlebsiellapneumoniae: high impact on mortality[J]. P N G Med J, 2009, 52(1-2):28.

[6]Bergeron MG, Oullette M. Preventing antibiotic resistanceusing rapid DNA-based diagnostic tests[J]. Infect Control Hosp Epidemiol,1998,19(8):560-564.

[7]李丹, 吳安華, 馮麗, 等.重癥監護室患者與環境分離的多重耐藥不動桿菌屬細菌同源性研究[J].中國感染控制雜志, 2008, 7(5):306-309.

[8]陳惠清, 林晨曦, 周春蓮.環境衛生質量對預防ICU多重耐藥菌醫院感染作用的研究[J].中國消毒學雜志, 2014, 31(5):493-497.

(本文編輯：陳玉華)

·論著·

Homology of carbapenem-resistantKlebsiellapneumoniaein an intensive care unit

PANHui-qiong，YUANXue-feng，ZHOUMin，LIXiao-ling，LILu-chi(TheFirstHospitalofChangsha,Changsha410005,China)

[Abstract]ObjectiveTo understand antimicrobial resistance and homology of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae (CRKP) from an intensive care unit (ICU).Methods11 CRKP isolates from patients and environment of an ICU in a hospital were performed antimicrobial susceptibility testing, the homology of CRKP was analyzed by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) method.ResultsOf 11 CRKP isolates, 8 were from patients, and 3 from environment, the main specimen was sputum(n=6, 54.55%). Antimicrobial susceptibility testing results revealed that 10 (90.91%) CRKP isolates were resistant to ciprofloxacin; 11 isolates were susceptible to compound sulfamethoxazole, intermediate to imipenem, and resistant to other antimicrobial agents(100%). All 11 CRKP isolates had 3 bands, and were divided into two types: (type Ⅰ, n=10; type Ⅱ, n=1).ConclusionAntimicrobial resistance of Klebsiella pneumoniae in ICU is serious, CRKP isolated from ICU patients and environment are of the same clone. Cleaning, disinfection, and monitoring of ICU environment should be strengthened, which is helpful for reducing, timely warning of multidrug-resistant organisms, and reducing healthcare-associated infection.

[Key words]Klebsiella pneumoniae; carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae; homology; intensive care unit; healthcare-associated infection

DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2015.12.011

[通信作者]王莉E-mail: toto-86@163.com

[作者簡介]王莉(1977-)，女(漢族)，江蘇省東臺市人，副主任醫師，主要從事醫院感染研究。

[基金項目]湖北省預防醫學會“消毒領域科研創新”(XKC2015-06)

[收稿日期]2015-05-22

[中圖分類號]R181.3+2R378

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-9638(2015)12-0827-03