大鼠同種異體神經支架修復神經缺損的實驗研究

劉良燚　劉　凱　張景石　李木衛　王　瑒深圳市龍崗區骨科醫院，廣東　深圳　518116

大鼠同種異體神經支架修復神經缺損的實驗研究

劉良燚劉凱張景石李木衛王瑒
深圳市龍崗區骨科醫院，廣東深圳518116

【摘要】目的:比較經脫細胞處理的同種異體神經支架修復大鼠坐骨神經缺損與自體神經移植修復效果的區別.方法: 32只SD大鼠隨機分為2組，每組16只，分別為脫細胞神經支架修復坐骨神經缺損組(A組)和自體移植組(B組).術后利用HE染色和透射電鏡觀察支架內結締組織重塑情況和神經超微結構的改變.結果:與自體移植組相比，單純脫細胞神經支架組細胞分布較紊亂，說明支架內結締組織已有增生重塑現象.通過透射電鏡觀察發現，單純脫細胞支架組的髓鞘形態與自體移植組的顯微結構沒有明顯的差異.結論:脫細胞異體神經支架異體移植后，能與自體神經移植修復缺損神經產生相似的移植效果.

【關鍵詞】神經支架;神經缺損;大鼠

周圍神經損傷在臨床上十分常見，尤其長段距離的神經缺損修復一直是困擾臨床的難題，目前自體神經移植的修復方式是臨床首選[1].然而自體移植手術存在供區有限、供區感覺或運動的失神經障礙、神經束錯位、神經活力隨時間衰減以及無血管生成能力等問題[2－3]，也是目前臨床應用無奈之舉.鑒于此，本研究擬通過比較同種異體脫細胞神經支架修復大鼠坐骨神經缺損與運用自體神經移植修復的效果的差異，以期為異體脫細胞神經支架作為自體神經移植替代治療提供部分研究基礎.

1　材料與儀器

1. 1儀器3131型CO2培養箱(美國Thermo公司); H－7650型透射電鏡(日本日立公司);熒光顯微鏡DM4000(德國Leica公司).手術器械及顯微手術器械(寧波成和醫療器械有限公司).

1. 2材料清潔級雄性SD大鼠，體重(300±42)g，購于中山大學實驗動物中心;實驗動物生產許可證號: SCXK(粵)2011－0029，實驗動物使用許可證: SYXK(粵)2011－0112.脫氧膽酸鈉、Triton X－100(美國sigma公司);其余試劑均為分析純.

2　方法

2. 1坐骨神經取材準備SD大鼠8只，作為制備脫細胞支架的神經供體來源，先用10%水合氯醛按10ml/kg腹膜浸潤麻醉充分后，再用75%酒精溺斃大鼠，并充分浸泡消毒10分鐘，將消毒后的大鼠置于超凈臺，無菌操作下逐層解剖雙下肢至顯露雙側坐骨神經，完整切取雙側坐骨神經干，8只大鼠共取出坐骨神經16條.

2. 2神經支架的制備將大鼠坐骨神經干在手術顯微鏡下小心去除神經干周圍筋膜和血管組織，并用無菌PBS緩沖液反復清洗.在常溫下進行如下步驟[4－5]:①在無菌蒸餾水中靜置6h;②3% TritonX－100中靜置12h;③無菌蒸餾水漂洗3次，然后用無菌PBS緩沖液漂洗3次;④4%脫氧膽酸鈉溶液靜置12h;⑤無菌蒸餾水漂洗3次，然后無菌PBS緩沖液漂洗3次.上述步驟完成以后得到大鼠脫細胞坐骨神經支架，將該支架置于PBS緩沖液4℃保存備用.

2. 3動物分組與坐骨神經缺損橋接實驗模型制備模型制備:按照隨機的原則將SD大鼠分為:單純脫細胞支架對照組(A組)和自體移植組(B組)，每組16只.常規消毒術野，鋪無菌巾，于后肢外側中上1/3處做橫行切口，切開皮膚約4. 5cm剪開筋膜組織，沿肌間隙由淺入深小心的鈍性分離，充分顯露坐骨神干經后，快刀切取長度為1. 5cm的坐骨神經.形成右坐骨神經干缺損動物模型，將脫細胞神經支架在10倍手術顯微鏡下修剪為長度1. 5cm，植于坐骨神經干缺損處，用10－0無創縫線，兩定點外膜縫合法吻合坐骨神經近端斷端于神經支架近端，縫合6針，依法吻合遠端斷端于神經支架遠端，創面充分止血，關閉創面.自體移植組以左右兩側坐骨神經干相互交換的方法進行，術中注意標記切取神經干的遠近端，以便正確回植.

2. 4神經再生的組織學觀察

2. 4. 1 HE染色取各組支架中段石蠟包埋切片，行常規HE染色.觀察再生神經中的細胞、軸突、髓鞘的形態.

2. 4. 2超薄切片透射電鏡觀察再生神經的超微結構的變化情況.

3　結果

3. 1一般觀察術后1. 5個月，兩組營養不良性改變均減輕，兩組再生神經外觀均接近正常神經組織，B組肌肉萎縮程度較A組輕，A組皮膚感覺及運動功能差于B組.術后2個月，兩組營養不良性改變均減輕，自體神經移植組肌肉萎縮程度輕，對針刺的反應敏感度及運動功能恢復較好.術后6個月，神經取材前觀察神經外觀情況，兩組神經連續性良好，與周圍組織無明顯粘連，無纖維神經瘤形成，移植段表面均有不同程度的血管化，A組中段較B組略細，B組形態結構基本接近正常神經組織.

3. 2神經支架的光鏡觀察實驗組和對照組的移植物段及其兩端未見肉芽組織，在其橫切面上移植物中段顯示大量的再生神經纖維集合形成許多由束膜包繞的神經束，并有完整的外膜包裹，兩組之間在光鏡觀察無明顯差異.

3. 3神經支架的HE染色分析由蘇木素－伊紅染色結果可見圖1，在移植物遠段神經組織橫切片上，單純脫細胞神經支架組、自體神經移植組標本均可見成束狀排列的神經樣組織、藍染的細胞核、新生毛細血管及少量的纖維組織增生，說明神經纖維已經生長至遠端.此外，自體神經移植組組細胞排列較為整齊，細胞核走形較為一致，單純脫細胞神經支架組細胞分布較紊亂，細胞核走形較為混亂，說明脫細胞支架內結締組織增生重塑現象明顯.

3. 4神經的超微結構分析由圖2可見，兩組神經纖維內均可見數條神經軸突纖維，軸突滿布髓鞘，在軸突內可見大量微絲、微管、新生毛細血管，細胞器豐富，軸突外有髓鞘包裹，髓鞘呈類圓形或不規則形，髓鞘壁厚薄均勻，可見同心圈層，髓鞘外周均有雪旺細胞胞質，胞質內細胞器豐富，胞核基本規整.兩組超微結構無十分明顯的差異.

圖1　神經支架HE染色（x100）

圖2　神經的超微結構

4　討論

周圍神經長距離缺損的修復一直是臨床難題，自體神經移植被認為是修復周圍神經缺損的金標準[5].因自體神經來源有限以及增加了手術部位和創傷造成該神經支配區的功能障礙，常無法滿足較大神經缺損或較廣泛神經損傷修復的需要.近年來有實驗表明[6－7]，脫細胞的同種異體天然神經支架優于其他人工制備的支架，不僅在于有較好的組織相容性，主要還在于去除有抗原性的細胞和髓鞘，而保留了抗原性極小的基底膜作為支架引導軸突沿移植物內管向遠端生長，引導宿主許旺細胞沿其內管壁向移植段遷移和增殖，避免或極大地減輕宿主的免疫排斥反，使軸突再生通過一段較長距離成為可能.同時獲得以施萬細胞基底膜管(SCBL)為主的神經外基質構成的三維管狀支架材料.軸突再生的研究表明，SCBL是由含豐富層黏蛋白(LN)的細胞外基質組成，它能夠促進宿主施萬細胞向神經移植段內遷移，引導軸突沿著SCBL的內面生長[8].

本實驗大體組織觀察發現:脫細胞神經移植段周圍組織黏連及瘢痕形成較輕微，神經連續性良好，無移植段吸收現象.說明脫細胞同種異體神經與自體神經一樣，是良好的神經缺損橋接修復材料，光鏡觀察發現脫細胞神經移植段中央顯示大量的再生神經纖維集合形成許多由束膜包繞的神經束，并有完整的外膜包裹，出現大量髓鞘形成的早期像，軸索位于橢圓形施萬細胞的一側.

經3% Triton X－100和4%脫氧膽酸鈉萃取的脫細胞同種異體神經支架，其神經修復過程未表現出對大鼠機體及周圍組織的毒性及炎癥刺激，新生神經軸突微管、微絲、毛細血管、細胞器等結構，髓鞘可見同心圓狀板層結構，雪旺細胞核清晰可見，其與自體神經移植修復無明顯差異.說明此種脫細胞同種異體神經支架有作為神經缺損修復的橋接物的潛力，可作進一步研究.

參考文獻

[1]Gregory H，Borschel，Kevin F Kia，et al．Mechanical Properties of Acellular Peripheral Nerve[J]．Journal of Surgical Research，2003，114: 133－139．

[2]Tasuo Nakamura，Yuji Inada，Seijun Fukuda，et al．Experimental study on the regeneration of peripheral nerve gaps through a polyglycolic acid collagen(PGA collagen)tube[J]．Brain Research，2004，1027: 18－29．

[3]KunjorT，Hirohito FT，Akira T，et al．Basic behavior ofmigratorySchwann cells in peripheral nerve regeneration[J]．Exp Neuro，1996，137(2): 301－3081．

[4]許揚濱，胡軍，江長青，等．去細胞同種異體神經構建獼猴組織工程化神經的實驗研究[J]．中華顯微外科雜志，2005，28(2): 136－138．

[5]高嵩濤，鄧展生，李寶軍，等．不同去細胞神經支架制備方法的對比研究[J]中國修復重建外科雜志，2008，10(7): 851－855．

[6]Flores AJ，Lavernia CL，Owens PW．Anatomy and physiology ofperipheral nerve injury repair[J]．Am JOrthop，2000，29(3): 167－1731．

[7]DumentCE，HentzVR．Enhancement of axon growth by detergent－extracted peripheral nerve grafts[J]．Transplantation．1997，63(8): 1210－12151．

[8]佟曉杰，劉承吉，張彩順，等．脫細胞同種異體神經移植物修復大鼠坐骨神經缺損的實驗研究[J]．解剖學報，2004，35(3): 230－233．

[9]WangGY，HiraiKI，ShimadaH．The role of laminin，a componentofSchwann cellbasal lamina，in rat sciatic nerve regenerationwithantiserum－treated nerve grafts[J]．Brain Res，1992，570(11): 116－1251．

收稿日期:( 2014. 12. 11)

作者簡介:劉良燚(1980－)，男，漢族，貴州遵義人，碩士，主治醫生，研究方向為周圍神經修復.E－mail: liuliangyi3@163. com

基金項目:深圳市龍崗區科技局項目(ys2012187).

【文章編號】1007－8517(2015)05－0073－02

【文獻標志碼】A

【中圖分類號】R745