清脈飲含藥血清對體外TNF－α損傷EAhy－926細胞的影響

康浩浩1魏　齊1魏彥寧1張偉芳2趙　凱3*1.寧夏醫科大學，寧夏　銀川　750004; 2.寧夏醫科大學附屬回醫醫院，寧夏　吳忠　751100;3.寧夏醫科大學總醫院中醫科，寧夏　銀川　750004

清脈飲含藥血清對體外TNF－α損傷EAhy－926細胞的影響

康浩浩1魏齊1魏彥寧1張偉芳2趙凱3*
1.寧夏醫科大學，寧夏銀川750004; 2.寧夏醫科大學附屬回醫醫院，寧夏吳忠751100;
3.寧夏醫科大學總醫院中醫科，寧夏銀川750004

【摘要】目的:研究清脈飲含藥血清對腫瘤壞死因子α(TNF－α)誘導的人臍靜脈內皮細胞(Ehay926)的影響.方法:制備含藥血清;將體外培養的EAhy－926細胞，隨機分為正常對照組、清法組、活血組、全方組、軟堅組、西藥組、TNF－α損傷組等;清脈飲含藥血清與TNF－α共同處理血管內皮細胞24h后，光學顯微鏡(下稱光鏡)下觀察細胞的形態變化，電子顯微鏡(下稱電鏡)下觀察細胞的細胞器改變.結果:①光鏡下細胞大體形態變化:清脈飲含藥血清與TNF－α共同處理的細胞，各組損傷均較少，細胞數量多，活血組細胞數量相對較少;②電鏡下細胞結構的改變:清脈飲含藥血清與TNF－α共同處理的細胞器損害較單純TNF－α損傷組的細胞小，其中以中劑清法組、軟堅組、西藥組對細胞器的損傷最少，細胞的超微結構與正常對照組比較沒有明顯差異.結論:清脈飲含藥血清可一定程度上對TNF－α損傷的血管內皮細胞保護作用，減少其對細胞器的損害，且含藥血清對細胞的保護作用存在血清濃度差異，其機制可能與抑制TNF－α的促炎作用以減少其對細胞器的損害有關.

【關鍵詞】清脈飲;含藥血清; TNF－α; EAhy－926

The influence of qing mai yin ontaining serum on VECs injuried by TNF－α

KANG Hao-hao1，WEI Qi，WEI Yan-ning1，ZHANG Wei-fang2，ZHAO Kai3
1. Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China; 2. Ningxia medical university affiliated to the medical hospital of traditional Chinese medicine，Wuzhong 751100，China; 3. Ningxia medical university general hospital，Yinchuan 750004，China

Abstract:Objective To research the influence of Qing Mai Yin medicated serum on human umbilical vein endothelial cells(EA-hy－926)by tumor necrosis factor alpha(TNF alpha)．Methods Preparation of medicated serum; The EAhy－926 cells were incubated in vitro and divided into normal control group，the low dose Qing Fa group，the normal dose Qing Fa group，the high dose Qing Fa group，Huo Xue group，Quan Fang group，Ruan Jian group，medicine group，TNF－α injury group etc．The serum containing medicine and different concentrations of Qing Fa serum containing handle with the TNF－αendothelial cells 24 hours after，morphological changes of EAhy－926 cells were observed under light microscope; cell organelles change of EAhy－926 cells were observed under the electron microscope; Results①The changes in general morphological cells under light microscope compared with TNF－α injury group，the serum containing medicine was significantly increased the cell viability，each group damage less and cell number，cells of Huo Xue group are relatively few;②The changes in the structure cells under electron microscope．The damage compared with TNF－α injury group，the serum containing medicine was significantly pure TNF alpha cells of small injury group．The cell organelles was least damage in Qing Fa group，Ruan Jian group，medicine group and the cell ultrastructure was no significant difference compared with normal control group．Conclusion Qing Mai Yin medicated serum can be a certain level of TNF alpha injury of vascular endothelial cell protection，reduce the damage to the organelles，and serum medicated serum concentration differences of cell protection，its mechanism may be related to inhibition of TNF－α proinflammatory role，reduce the damage to the organelles．

Key words:Qing mai yin; containing serum; TNF－α; EAhy－926

動脈粥樣硬化閉塞癥(Atherosclerotic Occlusion，ASO)是指動脈粥樣硬化(Atherosclerotic，AS)累及周圍動脈并引起慢性閉塞的一種AS相關疾病.而AS與高血脂、高血壓、糖尿病、吸煙、年齡、遺傳的關系已基本確定，近年來證實感染因素亦是誘發原因之一.此類疾病病程較長、病情較重、病人痛苦、難以根治，嚴重危害著人類的健康.在對有關動脈粥樣硬化的發病機制理論研究中，Ross[1－2]早在1974年提出，Ross教授后來又較系統全面地綜述了多年文獻，以新的論據在損傷反應學說的基礎上，明確提出“AS是一種炎癥性疾病”，認為內皮損傷，不論物理損傷還是更細微的細胞損害是動脈粥樣硬化中一個重要的早期事件.內皮損傷不但是指內皮剝脫，還包括內皮功能變化及內皮功能障礙[3].近年發現內皮功能損害是動脈粥樣硬化發病的首要和最早環節，且是導致其不斷進展的重要因素[4]，所以AS的早期防治和開發新藥成為研究的重點.中藥治療AS相關疾病臨床療效顯著，并有一定預防作用，有良好的發展前景.目前此類研究多集中在活血化瘀方面，從清法藥物對動脈粥樣硬化進行研究的較少.因此，本實驗擬從中醫不同治法含藥血清對TNF－α損傷的EAhy－926細胞的影響進行研究，為進一步明確其保護血管內皮的可能機制.

1　材料和方法

1. 1試劑、動物腫瘤壞死因子α(批號: 0607B25，美國PEPRO TECH公司); DMEM(Hyclone批號: NZH1209); PBS(Hyclone批號: NZH1195);胎牛血清(Hyclone批號: NZH1439);胰蛋白酶(Hyclone批號: J140028);二甲基亞颯(Sigma批號: BCBH2085V，美國Sigma公司).SD雄性大鼠60只，體重(250±50)g，普通級，由寧夏醫科大學動物中心提供[scxk(寧)2013－0035].

1. 2藥物全方(清脈飲):垂盆草、大黃、昆布、煅牡蠣、丹參、蒲黃、姜黃、夏枯草、茵陳、澤瀉、海藻等;清法組:大黃、垂盆草、夏枯草、昆布等;軟堅組:昆布、煅牡蠣、海藻、夏枯草等;活血組:丹參、蒲黃、姜黃、大黃等;以上中藥均由寧夏古方大藥房提供，各組方藥分別按照傳統中藥煎煮方法，煎煮、濾液，根據大鼠的體重計算用藥量后，濃縮至需要濃度[5]，用蒸餾水配制.西藥組:辛伐他汀片(批號: 110622，山東羅欣藥業股份有限公司)10mg/片.

2　實驗方法

2. 1含藥血清的制備

2. 1. 1分組及給藥方法將56只雄性SD大鼠隨機分為八組(即正常對照組、低劑量清法方組、中劑量清法方組、高劑量清法方組、全方組、軟堅方組、活血組、辛伐他汀組)，每組7只.按體型系數換算法[6]中人鼠等效藥量換算方法計算給藥劑量，全方組16. 9g/(kg· d)，低劑清法方組2. 9g/(kg·d)，中劑清法方組5. 99g/(kg·d)，高劑清法方組12. 21g/(kg·d)，軟堅方組2. 61g/(kg·d)，活血方組1. 7g/(kg·d)(均為生藥量)，辛伐他汀組0. 67mg，給大鼠灌胃，同時以等量生理鹽水灌飼正常對照組，每日一次.

2. 1. 2動物采血及分離血清每天灌胃2次，連續3d后，當夜禁食不禁水，第4d再給藥一次，中藥組在末次給藥后1. 5～2h，西藥組在給藥后1h心臟采血;加蓋靜置2h后，待血液固縮，無菌條件下分離血清，離心(3000r/min，15min);同組混合用0. 22μm的濾器過濾以消除個體差異，再水浴鍋滅活(56℃，30min)，分裝1ml EP管中，－20℃保存備用.

2. 2 TNF－α的溶解及配制①試劑開蓋前，將TNF－α凍干粉離心5min，3000～3500r/min;②用無菌水重懸至0. 1～1. 0mg/ml，用移液槍的槍頭輕吹幾下，即可使細胞因子完全溶解，不可振蕩，將重懸液靜置于室溫下2h以上;③用含10%胎牛血清的DMEM培養液稀釋成20ng/ml，分裝，－20℃保存備用.

2. 3人臍靜脈內皮細胞(EAhy－926)培養細胞由上海市中國科學院細胞庫提供，用含有10%胎牛血清的DMEM培養基，同時加入100U/ml青霉素和0. 1mg/ml鏈霉素，在37℃，體積分數5% CO2的細胞培養箱中培養細胞;待細胞生長至近匯合狀態、鋪滿瓶壁80%以上時，進行傳代;將生長良好的人EAhy－926用0. 25%的胰蛋白酶1ml消化1～3min后，輕輕吹打制成細胞懸液，每周傳代2～3次;取對數生長期的細胞消化后以1× 105/ml，接種于96孔板中培養，待細胞處于增殖期后分組實驗.

2. 4細胞的分組及給藥方法取對數生長期的細胞，將其消化，以含10%胎牛血清的DMEM培養液制成細胞懸液以1×105/ml，200μl/孔接種于96孔板或4×105/ml接種于25cm培養瓶中，37℃，5% CO2培養24h，細胞貼壁，近乎融合，吸棄培養液，用含0. 2%胎牛血清的DMEM培養液靜止24h，使細胞同步化至G1期，然后隨機分為9組:正常對照組; TNF－α組;低劑清法組;中劑清法組;高劑清法組;全方組;軟堅組;活血組;西藥組.加入TNF－α及各濃度含藥血清，37℃，5%CO2，培養育24h，待測.

2. 5實驗方法

2. 5. 1光鏡觀察細胞的大體形態取對數生長期的細胞消化后以1×105/ml制備成細胞懸液，200μl/孔，種于96孔板，待細胞貼壁后，換用含0. 2%胎牛血清的DMEM孵育24h，使細胞同步化，同時加入各濃度不同含藥血清及TNF －α(20ng/ml)的混合液，200μl/孔，孵育24h后，光鏡下觀察細胞的大體形態變化[5].

2. 5. 2電鏡觀察細胞超微結構

2. 5. 2. 1前固定①取對數生長期的細胞消化后種于25cm2培養瓶中，待細胞貼壁后，換用含0. 2%胎牛血清的DMEM孵育24h，使細胞同步化，同時加入各濃度不同含藥血清及TNF－α(20ng/ml)的混合液孵育24h，用0. 25%胰蛋白酶將其消化，離心800r/min，5min，收集細胞;②加入固定液1ml，重懸，4℃靜置10 min;③4℃離心800r/min，5min，去上清，盡量除凈;④加入固定液1ml，重懸，4℃靜置30min;⑤4℃離心r/min，5min，去上清;⑥加入0. 1M二甲砷酸鈉緩沖液1ml，重懸，4℃靜置1h;⑦4℃離心800r/min，5min，去上清;⑧重復操作步驟⑥兩次、⑦一次;⑨4℃保存，每周換一次0. 1M二甲砷酸鈉緩沖液.

2. 5. 2. 2后固定①離心800r/min，5 min，去上清;②加入1ml 1%鋨酸，輕混勻，4℃靜置1h;③離心800r/min，5 min，去上清;④加入1ml 0. 1M二甲砷酸鈉緩沖液，混勻，4℃靜置15min;⑤離心800r/min，5min，去上清;⑥重復操作步驟④、⑤.

2. 5. 2. 3脫水①依次加入30%、50%、70%冷乙醇，混勻，4℃靜置5 min，離心800 r/min，5 min，去上清;②依次加入80%、90%冷乙醇，混勻，室溫靜置5min，離心800r/min，5min，去上清;③加入100%常溫乙醇，混勻，室溫靜置3min，離心800r/min，5min，去上清;④重復操作步驟③;⑤加入環氧丙烷滲透，室溫靜置15h，離心800 r/min，5min，去上清;⑥重復操作步驟⑤;⑦1∶1不完全包埋液，室溫滲透1h.

2. 5. 2. 4包埋①離心800 r/min，5min，去上清;②將細胞全部轉入膠囊中，加入完全包埋液;③離心800 r/min，5min，使細胞沉在膠囊底部;④加上標簽，35℃溫箱6h; ⑤42℃溫箱6h;⑥60℃溫箱6h.

2. 5. 2. 4切片觀察700及2500倍下觀察細胞超微結構的改變.

3　結果

3. 1光鏡下細胞大體形態變化正常對照組內皮細胞為單層，數量多，飽滿，互不重疊，呈鋪石狀鑲嵌排列，邊界清楚; TNF－α損傷組細胞數量少，細胞間隙增寬，細胞收縮，胞膜皺縮，細胞邊界不清; TNF－α與含藥血清共同處理的細胞，各組損傷均較少，細胞數量多，細胞間隙變窄，形態趨于正常，活血組細胞數量相對較少，見圖1～4.

圖1　光鏡下正常對照組細胞形態（100x）

圖2　光鏡下清法組細胞形態（100X）

圖3　光鏡下TNF-α損傷組細胞形態（100X）

圖4　光鏡下活血組細胞形態（100X）

3. 2電鏡下細胞結構的改變①體外正常培養的血管內皮細胞，胞膜完整，連續，雙層結構，表面可見微絨毛;細胞核圓形或橢圓形，染色質均勻，無固縮;內質網無擴張，線粒體未見腫脹.②TNF－α損傷組，內皮細胞損傷明顯，胞膜破損，不連續，欠完整;核膜雙層結構消失，核膜擴張，表面微絨毛減少;細胞核固縮、變形，甚至消失，核內多個核仁，核染色質不均勻、聚集明顯;內質網擴張，線粒體腫脹、變性，胞漿內出現大量大小不等的空泡;鏡下見大量壞死的細胞碎片及凋亡小體.③TNF－α與含藥血清共同處理的內皮細胞，其損害較單純TNF－α損傷組的細胞小，細胞膜較連續完整;細胞核變形較輕，核染色質較均勻，聚集較少，核仁清晰可見;內質網及線粒體未見明顯擴張及腫脹、變性，胞漿內空泡明顯縮小或減少;鏡下很少見壞死細胞碎片，未見凋亡小體.其中在TNF－α損傷實驗同時加入含藥血清的全方組、高、中、低劑清法組、軟堅組、西藥組較損傷組、活血組對細胞器的損傷最少，細胞的超微結構與正常對照組比較沒有明顯差異(細胞膜較連續完整;細胞核變形較輕，核染色質較均勻，聚集較少，核仁清晰可見;內質網及線粒體未見明顯擴張及腫脹、變性，胞漿內空泡明顯縮小或減少).活血組對細胞器的損傷較多，細胞的超微結構損傷較大(內皮細胞損傷較明顯，胞膜不連續，欠完整;部分核膜雙層結構消失，核膜擴張，表面微絨毛減少;部分細胞核固縮、變形，甚至消失，核內多個核仁，核染色質不均勻、聚集明顯;內質網擴張，線粒體腫脹、變性，胞漿內出現少量空泡;鏡下可見少量壞死的細胞碎片及凋亡小體).10%低劑清法組、10%中劑清法組、10%高劑清法三組細胞的超微結構未見明顯差異.見圖5～22.

圖5　電鏡下正常對照組細胞形態（700x）

圖6　電鏡下正常對照組細胞形態（2500x）

圖7　電鏡下TNF-α損傷組細胞形態（700X）

圖8　電鏡下TNF-α損傷組細胞形態（2500X）

圖9　電鏡下低清法組細胞形態（700X）

圖10　電鏡下低清法組細胞形態（2500X）

圖11　電鏡下中清法組細胞形態（700X）

圖12　電鏡下中清法組細胞形態（2500X）

圖13　電鏡下高清法組細胞形態（700X）

圖14　電鏡下高清法組細胞形態（2500X）

圖15　電鏡下全方組細胞形態（700X）

圖16　電鏡下全方組細胞形態（2500X）

圖17　電鏡下活血組細胞形態（700X）

圖18　電鏡下活血組細胞形態（2500X）

圖19　電鏡下軟堅組細胞形態（700X）

圖20　電鏡下軟堅組細胞形態（2500X）

圖21　電鏡下西藥組細胞形態（700X）

圖22　電鏡下西藥組細胞形態（2500X）

4　討論

ASO屬中醫“脈痹”、“脫疽”范疇，多認為是由于飲食不節、臟腑虧虛、外邪侵襲導致濕熱痰濁瘀血互結，脈絡閉阻而成.傳統治療往往采用活血祛瘀消痰之法，各項研究也較集中在活血化瘀領域，較易忽視痰瘀皆為邪氣所致，所謂“虛邪賊風”總是疾病之起因，而邪被認為是導致各種脈管病的致病因子.由全國脈管病泰斗奚九一教授提出的“因邪致瘀”理論，首倡以軟堅清法為主治療ASO，療效滿意[7].趙凱教授在此基礎上提出“毒滯脈絡”，提出治療ASO法貴清通[8]，臨床運用清脈飲治療動脈硬化相關疾病取得良好療效.

現代研究表明，在AS的整個發生發展過程中，血管內皮細胞損傷導致的內皮功能障礙不僅是AS的一個始動環節，還是導致其不斷進展的重要因素[9].血管內皮細胞(vascular endothelial cell，VEC)是循環血液與血管平滑肌間的機械屏障，也是人體最大、最重要的內分泌器官.血管內皮細胞在各種刺激下產生促炎因子，在促炎因子作用下引起內皮損傷.因此，在預防和治療動脈粥樣硬化過程中，預防內皮細胞損傷的作用研究顯得尤為重要.本研究采用體外培養EAhy－926細胞細胞，探討清脈飲含藥血清對TNF－α誘導的EAhy－926細胞超微結構的影響.

TNF－α由活化的巨噬細胞、內皮細胞和平滑肌細胞合成，在細胞因子級聯反應中刺激其它細胞因子的合成，并且參與促進黏附分子的表達、炎癥細胞的募集和激活，是炎癥反應的關鍵調節因子之一，還可通過影響脂質代謝而促進AS[10－11].當TNF－α誘導血管內皮細胞損傷后，內皮細胞的損傷又促進白細胞介素－1和TNF－α釋放，同時TNF－α對血管內皮細胞再次產生細胞毒作用，進一步導致血管內皮細胞的損傷，從而形成惡性循環[12].TNF－α是炎癥反應的關鍵調節因子之一，可從多種炎癥細胞中釋放，在動脈粥樣硬化形成和發展過程中起著關鍵的作用;可抑制一氧化氮合酶的生成、誘導血管內皮細胞凋亡、促進細胞的老化及刺激血管內皮細胞表達粘附分子，導致內皮細胞功能障礙，促使血栓形成[13－14];并且可以刺激炎癥因子的產生，直接發揮促炎作用[13－15].故在動脈粥樣硬化發生發展中TNF－α起著關鍵的作用[3].TNF－α是通過對內皮細胞的損傷，促進動脈粥樣硬化的發生.因此，抑制TNF －α對內皮細胞的刺激作用，改善和恢復血管內皮功能已經成為AS防治的重要目標之一.

實驗結果顯示，光鏡下，TNF－α與含藥血清共同處理的細胞，各組損傷均較少，細胞數量多，細胞間隙變窄，形態趨于正常，活血組細胞數量相對較少;電鏡下，全方組、高、中、低劑清法組、軟堅組、西藥組較損傷組、活血組對細胞器的損傷最少，細胞的超微結構與正常對照組比較沒有明顯差異(細胞膜較連續完整;細胞核變形較輕，核染色質較均勻，聚集較少，核仁清晰可見;內質網及線粒體未見明顯擴張及腫脹、變性，胞漿內空泡明顯縮小或減少)，而活血組對細胞器的損傷較多，細胞的超微結構損傷較大(內皮細胞損傷較明顯，胞膜不連續，欠完整;部分核膜雙層結構消失，核膜擴張，表面微絨毛減少;部分細胞核固縮、變形，甚至消失，核內多個核仁，核染色質不均勻、聚集明顯;內質網擴張，線粒體腫脹、變性，胞漿內出現少量空泡;鏡下可見少量壞死的細胞碎片及凋亡小體.).低劑清法組、中劑清法組、高劑清法三組細胞的超微結構未見明顯差異.證實了中醫不同治法含藥血清對TNF－α損傷的EAhy－926細胞有一定的保護作用，其機制可能與抑制TNF－α炎癥反應有關，其可能是治療動脈粥樣硬化的作用機制之一.

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收稿日期:( 2014. 12. 10)

通信作者:趙凱(1969－)，男(滿族)，北京人，教授，主任醫師，醫學博士，碩士研究生導師.主要從事中西醫結合臨床、教學工作，以及風濕性疾病、周圍血管病和內分泌代謝性疾病的臨床及基礎研究，E－mail: exkl@163. com

作者簡介:康浩浩(1988－)，男，在讀碩士研究生，主要從事風濕性疾病、動脈粥樣硬化的研究.

基金項目:國家自然科學基金(81160432).

【文章編號】1007－8517(2015)05－0019－04

【文獻標志碼】A

【中圖分類號】R285. 5