炭疽桿菌基因檢測方法研究進展

李鳳元

（遼寧省重大動物疫病應急中心110161）

炭疽桿菌基因檢測方法研究進展

李鳳元

（遼寧省重大動物疫病應急中心110161）

近年來，動物炭疽病在我國北方地區夏季汛期時有發生。動物發生炭疽疫情時，要對疑似炭疽動物盡快進行確診。另外，在疫情防控期間不可避免地對周圍環境造成一定程度的污染，而最有可能污染土壤和水源。炭疽桿菌進入土壤就會形成芽孢，芽孢對惡劣環境具有極強的抵抗能力，可存活數十年。而進入水源后，極易污染水流流經的其他地區，使其成為新的潛在炭疽疫源地。當炭疽芽孢被攝入動物體內時會導致嚴重的菌血癥，進而會不同程度的引發炭疽疫情。因此，及時有效的診斷，以及在使用有效消毒藥物對周圍環境進行消毒后對疫區土壤、水源的污染狀況進行調查是十分必要的。本文介紹了針對炭疽桿菌基因檢測方法的研究進展，為該病的診斷、環境污染監測、疫情防控提供技術依據。

炭疽桿菌；檢測方法；研究進展；綜述

炭疽是由炭疽桿菌 （Bacillus Anthrax）感染引起的一種人獸共患病。由于炭疽芽孢和細菌本身的性質，直接以其為靶標的檢測技術在特異性、靈敏度等方面已難以獲得突破性的進展。雖然應用比較復雜的儀器設備可能解決部分問題，但由此帶來的復雜度及費用增加又難以避免[1]。在炭疽檢測上，由于基因技術的發展使得針對基因檢測方法已達到較為理想的效果，靈敏、高效是此類技術最大的優勢，基因檢測技術已經逐漸取代基于芽孢和細菌繁殖體的檢測方法。現將炭疽桿菌基因檢測技術的研究進展分別進行介紹。適合于針對環境中炭疽病原體以及感染動物的檢測。

1 基因檢測技術

1.1 PCR技術和探針技術

很多學者采用PCR技術對炭疽桿菌或芽孢進行檢測，只要靶位合適，引物設計合理，就會獲得良好的檢測效果。榮光華等建立的實時定量PCR檢測靈敏度可達到每個反應10～100個拷貝，利用12種相關菌株評價后獲得100%特異性，對10份模擬污染標本和20份對照標本檢測，所有污染標本均被檢出，所有對照標本均為陰性[2]。曲識、史清海等采用TaqMan熒光探針技術，針對炭疽芽孢桿菌pXO1、pXO2質粒上的基因設計引物，建立了一種簡便、快速、定量檢測炭疽芽孢桿菌的PCR方法，可特異且靈敏地檢測土壤標本中可疑目標菌，檢測靈敏度可達 2.5×103cfu/早土壤[3，4]。 譚維國等分別針對炭疽桿菌capA基因和PA基因設計引物以及熒光雙標記探針，通過優化探針、引物濃度、反應體系試劑組分等參數，建立了可同時檢測capA基因和PA基因的雙重實時熒光PCR方法，其檢測靈敏度分別可達到每個反應5和50拷貝，且具有良好的特異性[5]。趙婷婷等建立了一種簡便的新型交叉引物恒溫核酸擴增結合層析試紙條方法，可以快速可視化檢測炭疽芽胞桿菌核酸。該方法是通過序列比對挑選出炭疽芽胞桿菌質粒上的特異性基因pXO2，設計引物、探針并合成標記，建立核酸恒溫擴增反應體系，用金標免疫層析試紙條快速檢測擴增產物。用建立的檢測方法檢測炭疽Sterne疫苗株的靈敏度為6×103cfu/ml，且與枯草芽胞桿菌、矮小芽胞桿菌、蕈狀芽胞桿菌等相似菌株無交叉反應，具有良好的敏感性和特異性[6]。

1.2 LAMP技術

華南農業大學農學院李亭潞等人曾針對荔枝炭疽病菌的GS基因序列設計了LAMP特異性引物，通過條件優化建立了檢測荔枝炭疽病菌的LAMP體系，通過檢測結果表明，LAMP引物特異性較好，能準確地從樣品中檢測出炭疽菌， 檢測靈敏度為 100f早/μl， 分別高于常規PCR檢測方法的100倍和10000倍[7]。 Ben Hatano等將LAMP技術應用于炭疽桿菌的檢測，在一個反應體系內 （25ul）能夠檢測大約1000個拷貝。雖然存在污染的可能性，但其極高的敏感性和特異性顯示了該項技術在檢測炭疽桿菌上的潛力[8]。

1.3 芯片技術

文海燕等針對炭疽芽孢桿菌、布魯菌、類鼻疽伯克霍爾德菌等5種生物恐怖細菌的特異性基因序列設計了6對引物和相應特異性探針，經多重PCR擴增并用生物素標記相應的基因片段，標記的PCR產物與包被在不同編碼微球上的相應探針雜交，用懸浮芯片掃描儀檢測其監測體系特異性好、靈敏度高，可以將炭疽芽孢桿菌作為檢測目標之一[9]。王靜等建立了基于雙抗體夾心免疫學檢測的編碼微球懸浮芯片方法，對炭疽桿菌芽孢檢測最低檢出限為4.2×103cfu/ml，動態范圍為103～107cfu/ml，該方法具有很好的敏感性和特異性[10]。

2 小結及展望

基于基因檢測技術在檢測炭疽桿菌上具有簡便、快捷、靈敏度高和特異性好等特點，在炭疽桿菌檢測方法的研究中，作為臨床診斷、環境污染監測、疫情防控等方面快速檢出炭疽桿菌的重要手段，基于基因的檢測技術將會進一步受到重視和得到發展。

[1]劉炬,徐俊杰,陳薇,等.炭疽桿菌檢測方法的研究現狀與展望 [J].微生物學報,2012,52(7):810-815.

[2]榮光華,夏懿,朱詩應,等.炭疽芽胞桿菌染色體特異序列的篩選及實時定量檢測[J].微生物學報,2006,46(6):900-905.

[3]曲識,史清海,何寧.定量PCR快速檢測炭疽芽孢桿菌的實驗研究[J].軍事醫學科學院院刊,2010,34(3):275-279.

[4]史清海.土拉弗朗西斯氏菌、炭疽芽孢桿菌定量PCR檢測技術的研究[D].史清海,2010.

[5]譚維國,陳文琦,呂恒,等.炭疽桿菌雙重實時熒光PCR檢測方法的建立[J].東南國防醫藥,2013,15(6):556-559.

[6]趙婷婷,孫文錚,楊宇,等.CPA恒溫擴增技術檢測炭疽芽胞桿菌方法的建立 [J].中國國境衛生檢疫雜志,2014,37(4):247-250.

[7]李亭潞,司徒俊鍵,江立群,等.荔枝霜疫霉和荔枝炭疽菌LAMP檢測技術的建立[J].中國菌物學會2015年學術年會論文摘要集,2015.

[8]HatanoB,MakiT,ObaraT,et al.LAMP Using a Disposable Pocket Warmer for Anthrax Detection,a Highly Mobile and Reliable Method for Anti-Bioterrorism[J].Japanese Journalof Infectious Diseases,2010,63:36-40.

[9]文海燕,王靜,劉衡川,等.五種生物恐怖細菌基因懸浮芯片多重檢測方法的建立[J].四川大學學報(醫學版),2009,40(2):325-329.

[10]王靜,楊赟韻,喬舜,等.懸浮芯片法與生物素-親和素ELISA法檢測炭疽桿菌芽孢比較研究[J].中國國境衛生檢疫雜志,2009,32(6):436-440.