惡性黑色素瘤免疫治療現狀

錢新宇 潘月龍

●綜 述

惡性黑色素瘤免疫治療現狀

錢新宇 潘月龍

惡性黑色素瘤是一種具有高度侵襲性的腫瘤類型，早期就容易通過淋巴和血行轉移，總體5年生存率低于10%，晚期惡性黑色素瘤5年生存率僅為5%左右，屬于最難有效治療的惡性腫瘤之一。與其惡劣的生物學行為似乎有些相悖的是惡性黑色素瘤往往表現出較好的抗原性和免疫原性[1-2]，例如：黑色素瘤的原發部位常常出現強烈的淋巴細胞浸潤，進而導致部分甚至完全的腫瘤緩解；白癜風的出現是黑色素瘤患者預后良好的標志[3]；免疫治療在惡性黑色素瘤的長期治療實踐中取得了肯定療效[4-5]。基于這些特性，惡性黑色素瘤被認為是免疫原性腫瘤的最佳代表，同時，免疫治療也被認為是惡性黑色素瘤治療的基石。隨著易普利單抗（Ipilimumab）和納武單抗（Nivolumab）等免疫檢查點抑制劑藥物在臨床試驗中的巨大成功，惡性黑色素瘤的免疫治療越來越受人關注，甚至引發了整個腫瘤領域的免疫治療熱潮。本文擬對近年來惡性黑色素瘤免疫治療的進展進行綜述，對指導臨床實踐提供一定的幫助。

1 細胞因子

目前應用于惡性黑色素瘤臨床治療的細胞因子主要包括IL-2和IFN兩類，屬于細胞免疫系統分泌的小分子蛋白。IL-2是輔助型T淋巴細胞活化產生的細胞因子，其作用主要表現在刺激自然殺傷細胞和T細胞的增殖和活化，并增強其抗腫瘤活性。大劑量IL-2（HD IL-2）被認為是首個用于黑色素瘤的免疫療法，美國FDA于1998年批準其用于不可切除的惡性黑色素瘤。所謂HD IL-2療法是指IL-2 600 000～720 000U/ kg，靜脈給藥，1次/8h，共14次，予治療的d1～5給藥，休息6～9d開始第2個療程。文獻表明HD IL-2總有效率為12%～21%，其中完全緩解（CR）約為6%，CR患者往往可獲得長期緩解，約50%患者持續緩解時間長達5年，提示部分CR的患者具有可治愈性[4]。盡管該方案充分發揮了IL-2的抗腫瘤作用，但也存在嚴重的不良反應，主要包括嚴重低血壓、肺水腫、因全身水腫導致的體重增加和腎功能不全、缺氧、心律失常、疲勞等[6]。腫瘤免疫治療學會（SITC）推薦大劑量IL-2為體力狀態（performance status，PS）評分好且無中樞神經系統疾病的BRAF野生型的Ⅳ期黑色素瘤的一線治療[7]。從國內的臨床實踐來看，極少有惡性黑色素瘤的患者采用HD IL-2療法。主要是受制于中國人的體質及前面提到的嚴重的不良反應，特別是嚴重的毛細血管滲漏綜合征，其極度兇險性以及處置要求的相對專業性導致病死率很高，阻礙了HD IL-2療法的臨床應用。另外，越來越多的研究提示，HD IL-2療法所獲得的CR患者長期生存并非其特有的，有可能是免疫治療共同的特征，再加上新的較低不良反應的免疫治療藥物和方法的問世，HD IL-2療法在惡性黑色素瘤的治療上的地位有可能被進一步削弱。黑色素瘤患者的遺傳背景會影響到IL-2的療效，近期文獻報道神經母細胞瘤鼠肉瘤病毒（NRAS）突變患者預測IL-2治療將獲得更好的效果[8]。基因分型后選擇性地應用IL-2治療，進一步提高有效率、減少治療相關性死亡，將是IL-2在黑色素瘤治療領域擺脫窘境，重新確立地位的可能選擇。

IFN具有多種生物學活性。應用于黑色素瘤治療的主要是IFN-α，特別是IFN-α2b。其主要通過抗增殖、誘導分化，修飾腫瘤細胞抗原、促進機體識別相關抗原和清除腫瘤細胞，以及抗血管生成等作用達到治療效果。中低劑量的IFN已被證實對惡性黑色素瘤無明確治療價值，不能提高患者無病生存率、無復發生存率和總生存率。只有大劑量IFN（HDI）治療可延長黑色素瘤切除術后高危患者的無復發生存時間，提高總生存率。美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）指南推薦HDI（2 000 wiu/m2d1～5×4周，1 000wiu/m2tiw×48周）為惡性黑色素瘤高危患者術后輔助治療方案，中國黑色素瘤診治指南同時推薦了中國患者治療經驗：1 500wiu/m2d1～5× 4周，900wiu tiw×48周，治療強度下調，使其具有更好的耐受性，但較國外標準劑量療效無統計學差異。另外，5年新型長效干擾素α2b（Peg-IFN-α2b）方案也已經被批準用于Ⅲ期惡性黑色素瘤術后輔助治療，相比HDI更易耐受，療效無統計學差異。但HDI治療對晚期惡性黑色素瘤缺乏療效，不推薦用于進展期黑色素瘤治療。不僅如此，近期KellyM.McMasters等[9]一項前瞻性隨機對照Ⅲ期研究發現僅單個前哨淋巴結（SLN）陽性的患者，無法從HDI輔助治療中獲益，而對于病理及免疫組化陰性但RT-PCR陽性的患者，淋巴結清掃術（CLND）及CLND＋HDI均無法延長總生存期，提示HDI輔助治療的獲益人群可能比較有限，結合HDI較高的不良反應發生率（3級毒性反應67%），指南的推薦存在進一步優化的可能。但是由于Ipilimumab在黑色素瘤輔助治療上表現出的較高的藥物相關性死亡，HDI的地位目前還不可動搖。

2 疫苗

腫瘤疫苗旨在通過激發腫瘤特異性T淋巴結細胞來增強機體免疫系統識別與殺傷腫瘤細胞能力。主要分為腫瘤抗原疫苗和細胞疫苗兩大類。該領域最成功的典型非Sipuleucel-T莫屬，它是全球第一個被FDA批準的腫瘤疫苗，2010年4月批準用于治療無癥狀或癥狀輕微的轉移性去勢治療無效的前列腺癌。Kantoff等[10]在臨床研究中，將512例對去勢治療無效的晚期轉移性前列腺患者隨機分成兩組，一組患者接受Sipuleucel-T治療，另一組接受安慰劑。結果提示：與安慰劑組相比治療組的死亡風險相對下降了22%（P=0.03），中位總生存期（overall survival，OS）延長了4.1個月（25.8個月vs21.7個月），這一結果極大鼓舞了腫瘤疫苗治療研究。

但是，疫苗治療在黑色素瘤治療領域卻沒有獲得突破性進展。2010年報道了一種針對腫瘤-睪丸、MAGE-A3抗原的蛋白疫苗——特異性腫瘤免疫治療（ASCI），其在針對不能手術切除的Ⅲ期或Ⅳ期惡性黑色素瘤患者的Ⅱ期臨床試驗中顯示了良好的前景[11]，但在之后的Ⅲ期臨床試驗中均未能獲得陽性結果，無法顯著延長黑色瘤患者的無進展生存期，是否能讓黑色瘤患者的某個亞群受益尚需期待進一步研究結果。另外一個治療黑色素瘤的腫瘤疫苗藥物Allovectin的Ⅲ期臨床研究也因未能達到其預期目標而宣告失敗。總的來說，黑色素瘤疫苗治療尚需時日。

3 溶瘤病毒（Talimogene laherparepvec，T-VEC）

T-VEC在惡性黑色素瘤治療領域的突破被認為是2015年度腫瘤免疫治療十大進展之一。T-VEC由1型單純孢疹病毒（HSV-1）經過程改造而獲得的。其作用機制主要通過特異性感染腫瘤細胞，并在腫瘤細胞內大量復制，導致宿主腫瘤細胞溶解和死亡。與此同時，死亡細胞釋放出的大量病毒顆粒產生級聯效應，放大溶瘤效果。腫瘤細胞的崩解，釋放出腫瘤源性抗原和GM-CSF入血，誘導全身的抗腫瘤免疫反應，增強疫苗的抗腫瘤效果。OPTiM等[12]研究共招募了436例發生遠端轉移或有不可切除區域的黑色素瘤患者，其中295例患者接受T-VEC治療，141例患者接受GM-CSF治療。研究的主要終點是持續緩解率（DRR），即從最初12個月內開始持續時間超過6個月的CR率+部分緩解（PR）率；次要終點包括總生存和總緩解率。臨床研究結果顯示T-VEC組DRR顯著高于GM-CSF組（16.3%vs 2.1%，P＜0.001）。其中，在持續緩解的患者中，29.1%的患者獲得持續CR，其余患者獲得持續PR。T-Vec組有更高的總緩解率（26.4%vs 5.7%，P＜0.001）。總體上來看，T-VEC組中共有32例（10.8%）患者獲得CR，而GM-CSF組中CR患者僅有1例（＜1%）。OS分別為23.3個月和18.9個月（HR=0.79，P=0.051），雖無統計學意義，但已經體現了一定的趨勢性特征。2015年10月27日，FDA根據該項研究結果批準了T-VEC（Imlygic）用于首次手術后復發的黑色素瘤患者不可切除的皮膚、皮下和淋巴結病灶的局部治療。這是首個獲得FDA批準的溶瘤病毒類治療藥物。T-VEC最常見的不良反應為寒戰、發熱以及流感樣癥狀等，但總體不良反應可控。研究者同時指出由于該治療藥物使用的是活的基因修飾的單純皰疹病毒，存在感染皰疹病毒的風險，因此禁用于孕婦和免疫受損的患者。T-VEC顯著的臨床療效為惡性黑色素瘤的免疫治療開辟了一片全新的天地，期待其與其它藥物或治療手段的聯合應用能獲得更佳的臨床試驗結果。

4 過繼性細胞免疫治療（adoptive cell therapy，ACT）

4.1 腫瘤浸潤T淋巴細胞 (tumor infiltrating lymphocytes，TIL） TIL是從腫瘤組織分離得到的，經過細胞因子比如IL-2誘導可體外培養并大量擴增的淋巴細胞。目前幾乎所有有關TIL治療的研究都在關注黑色素瘤，其在黑色素瘤的療效令人矚目。1986年Rosenberg等[13]在Science發表的研究，開創性使用自體TIL聯合環磷酰胺在小鼠模型中可使黑素瘤轉移灶消退。1988年Rosenberg等[14]報道了TIL治療人類轉移性黑色素瘤療效。首先是通過靜脈使用環磷酰胺預先清除患者的淋巴細胞，再進行TIL靜脈回輸，同時聯合IL-2，以促進抗腫瘤T細胞存活和擴增。該研究共入組20例轉移性黑色素瘤，12例患者達到了PR或CR。2008年該研究團隊采用環磷酰胺聯合氟達拉濱清除體內的免疫細胞，然后將體外擴增TIL回輸，獲得了51.4%的緩解率，平均緩解期達11.5個月[15]。2011年該研究團隊采用全身照射（total body irradition，TBI）聯合化療（環磷酰胺+氟達拉濱）的方法徹底清除患者體內的免疫細胞然進行TIL回輸，結果顯示，化療+TIL組43例黑色素瘤患者客觀緩解率（objective response rate，ORR）為49%，化療+2Gy TBI+TIL組25例黑色素瘤患者ORR為52%，化療+12Gy TBI+TIL組25例黑色素瘤患者ORR為72%；3組的CR率分別為12%、20%、40%[16]。這是迄今為止報道的療效最顯著的過繼免疫治療方法。但在接受12Gy TBI組中約1/3的患者會出現血栓性微血管病變的并發癥，發生時間多在接受治療后的4～12個月[17]。該不良反應也應引起關注。有研究顯示，TIL在轉移性惡性黑色素瘤治療中的ORR為50%，CR約20%，當然，由于TIL細胞制備的特殊性，深入該領域的研究團隊相對較少，該領域內的研究尚缺乏令人信服的設計合理的大樣本多中心隨機臨床研究，但是這并不妨礙有條件的醫療機構去做更多有益的嘗試。最新臨床研究還提示：肢端、黏膜或BRAF突變的患者更能通過TIL治療獲益，既往使用過免疫檢查點抑制劑的患者療效欠佳。

4.2 基因修飾的T細胞 T細胞受體（TCR）基因修飾的T細胞和嵌合抗原受體修飾的T細胞（chimeric antigen receptor T-cell，CAR-T）是當前過繼性細胞免疫中兩大最新的技術。

TCR基因修飾的T細胞是將運用基因轉染技術構建好的腫瘤抗原特異性TCR，通過病毒載體等方法轉入T細胞，體外大量擴增后回輸患者，進而發揮特異性的抗腫瘤效應。目前研究較多的靶抗原有：紐約食管鱗狀細胞癌1（New York oesophageal squamous cell carcinoma-1，NY-ESO-1）、T細胞識別的黑素瘤抗原1（melanoma antigen recognized by T cells 1，MART-1）、黑素瘤抗原A3（melanoma antigen A3，MAGE-A3）和糖蛋白100（glycoprotein 100，gp100）等。第1個針對NYESO-1基因采用TCR基因修飾治療惡性黑色素瘤的臨床試驗結果于2011年發表在Journal of Clinical Oncology上。該試驗入組了11例黑色素瘤患者，其中5例黑色素瘤患者在治療后癥狀改善，2例CR且持續時間1年以上，顯示了良好的應用前景[18]。需要指出的是該方法受制于能否獲得可特異性識別腫瘤抗原的TCR，既與實驗室技術水平相關，也與腫瘤本身抗原表達情況相關，因此很難在黑色素瘤患者群中廣泛開展。

CAR-T技術是近年來發展非常迅速的一種過繼性細胞免疫治療技術，在血液腫瘤中已經獲得了令人矚目的成功。該技術是將能識別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結合部與CD3ζ或FcεRIγ的胞內部分在體外偶聯為一個嵌合蛋白，通過基因轉導的方法轉染患者的T細胞，使其表達嵌合抗原受體，激活其抗原特異性識別能力。目前，CAR的信號域已從第一代的單一信號分子發展為包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信號結構域（第2、3代），并且在進一步發展中。雖然CAR-T治療在血液系統腫瘤中顯示了良好的應用前景，但在實體瘤中，CAR-T的進展仍然十分有限，該技術同樣面臨腫瘤特異性抗原選擇的復雜問題，在黑色瘤中的研究大多也處于臨床前研究階段，以NY-ESO-1抗原為靶點的CAR-T在轉移性黑色素瘤患者中觀察到了一定的療效[19]，期待更有說服力的臨床研究結果。另外，在CAR-T的治療過程中，也出現了嚴重的不良反應，如細胞因子風暴，表現為低血壓、呼吸困難、譫妄、神經毒性等，嚴重者導致患者死亡，或者需要重癥監護，應引起重視。

5 免疫檢查點抑制劑

免疫檢查點療法是一類通過調節T細胞活性來提高抗腫瘤免疫反應的治療方法。所謂的免疫檢查點其實是免疫系統中的抑制性通路，它們本來的作用是為了避免自身過度免疫，但在腫瘤患者中免疫檢查點卻與腫瘤的免疫逃逸息息相關。免疫檢查點通路由配體/受體相互作用來調控，因此與此相關的蛋白均可成功免疫檢查點抑制劑的潛在靶點。細胞毒性淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen 4，CTLA-4）是第1個應用于臨床的T細胞免疫檢查點，其次是程序性死亡受體1（programmed death 1，PD-1）與其配體PD-L1。近年來以CTLA-4單抗和PD-1/PDL1單抗為代表的免疫檢查點抑制劑在黑色素免疫治療領域取得了令人鼓舞的研究成果，顯示了強大的抗腫瘤效應，體現了良好的應用前景。

CTLA-4主要表達于T細胞表面，是其活性的負性調節蛋白。CTLA-4單抗的作用機制是特異性地結合CTLA-4，阻斷其與B7的相互作用，恢復CD28/B7共刺激信號，從而恢復T細胞的免疫活性。目前常見的CTLA-4單抗主要有Ipilimumab和Tremelimumab。

Ipilimumab已經被多項研究證實在一線、一線聯合化療、二線治療進展期黑色素瘤中具有明確療效，能顯著延長患者的總生存期，Tremelimumab也取得了相似的臨床研究結果。一項隨機對照Ⅲ期入組了502例初治的進展期惡性黑色素瘤患者，隨機分入Ipilimumab+氮烯咪胺組（250例）和Ipilimumab+安慰劑組（252例）。臨床試驗結果提示：兩組5年生存率分別為18.2%、8.8%（P=0.002）。生存曲線平臺都出現在治療的第3年。該研究結果表明Ipilimumab可使晚期黑色素瘤長期獲益[20]。正因為其在前述領域的良好表現，Ipilimumab在黑色素瘤輔助治療中的臨床研究被報以很大的期望。Ⅲ期臨床結果顯示[21]：與安慰劑相比，Ipilimumab可將Ⅲ期或可手術的Ⅳ期惡性黑色素瘤患者的無復發生存率（RFS）提高近9個月（26.1個月vs 17.1個月）；3年RFS為46.5%，與HDI相比提高了4.5%。2015年10月，美國FDA批準Ipilimumab用于治療Ⅲ期的皮膚黑色素瘤患者的術后輔助治療,成為近20年來黑色素瘤患者輔助治療的首個新治療方法。但是該臨床研究中Ipilimumab表現出了較大的不良反應，過高的藥物相關性致死事件是輔助治療的患者無法完全接受的，因此，Ipilimumab想要完全取代HDI成為惡性黑色素瘤術后輔助治療的最佳選擇仍有很長的路要走。

PD-1也主要表達于T細胞表面，也可表達于B細胞及單核細胞表面，是一種抑制性受體，其配體為PDL1和PD-L2（B7-H1和B7-H2）。與配體結合活化后，可導致T細胞失能、耗竭或死亡。PD-1單抗可通過特異性阻斷者PD-1的活化，恢復患者T細胞活性發揮抗腫瘤免疫效應。

Nivolumab是美國施貴寶公司研發的IgG4單克隆抗體，2014年獲批用于治療晚期不可切除的黑色素瘤患者，是全球首個獲批的PD-1抑制劑。2014年ASCO會議上Hodi教授報道了Ⅰ期臨床研究（BMS-936558）數據，對于未接受過Ipilimumab治療的晚期黑色素瘤患者，ORR達28%，中位無進展生存期（progression free survival，PFS）9.7個月，中位OS為20.3個月，1、2、3年生存率分別為63%、48%和42%。亞組分析發現Nivolumab療效與腫瘤組織PD-L1表達相關，PD-L1陽性患者中位PFS約9.1個月，顯著高于陰性患者的1.9個月，提示腫瘤組織PD-L1的表達可能是預測療效指標。不良反應主要表現為免疫介導腸炎、肝炎、甲狀腺功能異常等，Ⅱ期臨床試驗顯示其免疫相關性不良反應的發生率約為14%，較Ipilimumab25.2%的歷史數據明顯減輕，其中3～4級不良反應發生率約5%[22]。在剛剛結束的2016年the American Association for Cancer Reseach（AACR）大會上Hodi教授報道了該臨床試驗長期隨訪的生存數據，該研究是目前PD-1治療試驗中隨訪時間最長的研究，4年和5年總生存率分別為35%、34%。生存曲線平臺都出現在治療的3～4年，此時即使停止治療，治療反應仍持續存在。因此，持續治療反應是免疫治療最驚艷的結果，與靶向和化療短時間耐藥截然不同，免疫系統對腫瘤的治療作用具有記憶效應，且不會產生耐藥性，使人們看到腫瘤治愈的希望。

Pembrolizumab是另外一種PD-1高親和力的IgG4單克隆抗體。最新研究報道KEYNOTE-001試驗655例晚期黑色素瘤患者接受Pembrolizumab治療長期隨訪結果，Pembrolizumab表明對晚期惡性黑色素瘤總體有效率可達33%，CR達6%，12個月的PFS率為35%，中位OS為23個月，1年和2年生存率分別為66%、49%。與Nivolumab相似，較Ipilimumab提高約20%，較標準化療藥物DTIC提高約40%。研究還提示Pembrolizumab越早使用可能獲得更大受益，一線使用CR高達13.5%，ORR高達45.1%，12個月的PFS為52%，中位 OS為31個月，1年和2年生存率分別為73%、60%。該試驗結果確立了Pembrolizumab在一線治療中的地位[23]。與Nivolumab相似，Pembrolizumab的療效也與患者腫瘤組織PD-L1表達密切相關，陽性表達是良好的療效預測指標，但與BRAF突變狀況無明顯相關性。因此，對于BRAF突變狀況不明PD-L1陽性的晚期惡性黑色素瘤患者Pembrolizumab可作為首選藥物。Pembrolizumab 3～4級不良反應發生率約 14%，與Nivolumab相似，主要表現為結腸炎（7%）和肝炎（3%）等，但仍相對可控。

PD-L1單抗的作用機制是特異性與PD-L1結合，阻斷其與PD-1的相互作用，進而抑制PD-1活化，提高T細胞活性。臨床結果提示PD-L1單抗BMS-936559和MPDL3280A在晚期黑色素瘤中ORR分別為17%和26%。由于PD-1存在兩個功能配體：PD-L1和PD-L2，所以僅拮抗PD-L1可能無法完全阻斷PD-1的活化，這就解釋了為什么PD-L1單抗的臨床療效遠不及PD-1單抗顯著。當然，其不良反應的發生率約9%，相應降低。因不良反應相對較低，有研究者將PD-L1單抗與多個分子靶向藥物比如BRAF抑制劑、MEK抑制劑等聯合使用，相關的臨床試驗正在進行中，結果值得期待。

CTLA-4單抗和PD-1單抗那個效果更好？一項Ⅲ期臨床試驗[24]解答了這個問題，該試驗入組834例晚期黑色素瘤患者，按照1∶1∶1隨機分為3組：Pembrolizum－ab每2周方案組、Pembrolizumab每3周方案組和Ipilimumab方案組。主要終點是無進展生存期和總體生存期。研究結果顯示，6個月無進展生存率分別為47.3%、46.4%和26.5%；12個月總生存率分別為74.1%、74.1%和58.2%；反應率分別為33.7%、32.9%和11.9%，3個指標在Pembrolizumab方案較Ipilimumab方案均獲得陽性結果，P＜0.001。3～5級治療相關的不良事件發生率在Pembrolizumab組較低（分別為13.3%，10.1%），Ipilimumab組19.9%，說明Pembrolizumab在療效上優于Ipilimumab，且不良反應更低。

雖然單一免疫檢查點抑制劑在惡性黑色素瘤治療領域已經取得了突破性進展，但療效仍然不十分令人滿意。某些研究者將針對不同免疫檢查點的兩種抑制劑聯用，希望能取得更好的治療效果。一項晚期黑色素瘤一線治療的臨床試驗結果提示[25]：Ipilimumab+ Nivolumab組，Ipilimumab+安慰劑組按照2∶1比例入組，ORR分別為61%、11%，CR分別為22%、0。值得關注的是，22%的患者在Ipilimumab和Nivolumab聯合治療后腫瘤CR，這樣的結果已經較以往單獨使用的療效有了明顯的提高。但不可忽視的是，聯合用藥帶來的嚴重的不良反應，其3～4級藥物相關性不良反應率高達54%，較單藥（24%）明顯增高。隨后的臨床試驗又進一步證實，Ipilimumab+Nivolumab聯合治療優于兩個單抗單用。結果提示：Ipilimumab+Nivolumab聯合組、Ipilimumab組、Nivolumab組的PFS分別為11.5、2.9、6.9個月。亞組分析，PD-L1陽性的患者，聯合組的PFS是14個月；PD-L1陰性的患者中，聯合組的PFS是11.2個月，Opdivo組是5.3個月；3～4級藥物相關性不良反應率3組分別為55.0%、27.3%、16.3%[26]。因此，聯合用藥療效與風險并存，如何使用還需結合臨床實際情況，因地制宜，因人而異。

此外，還有眾多針對不同免疫檢查點的抑制劑正在進行臨床前或者早期的臨床研究，例如針對CD40、CD137、OX40、LGA-3、TIM-3等的抑制劑，總的來說取得了一定療效，具有一定前景，但還沒有涌現出類似CTLA-4、PD-1/PD-L1這樣療效確切的靶點。

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2016-04-19）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省科技廳公益項目（2014C33119），杭州市科技發展計劃項目（20130633B07），杭州市衛生科技項目（2013A02）

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