高通量測(cè)序技術(shù)及其發(fā)展

陳怡河南師范大學(xué)

高通量測(cè)序技術(shù)及其發(fā)展

陳怡
河南師范大學(xué)

摘要：高通量測(cè)序技術(shù)是DNA測(cè)序的革命性技術(shù)創(chuàng)新，具有同時(shí)對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子進(jìn)行測(cè)序和一般的讀長(zhǎng)較短的功能。速度快、準(zhǔn)確率高、成本低，實(shí)現(xiàn)了對(duì)物種基因組或轉(zhuǎn)錄組的深入研究。該文詳細(xì)介紹了高通量測(cè)序技術(shù)的種類和測(cè)序原理，以及各種測(cè)序平臺(tái)的發(fā)展進(jìn)程和優(yōu)缺點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序技術(shù)；454焦磷酸測(cè)序；Solexa測(cè)序；SOL?ID測(cè)序；第三代測(cè)序技術(shù)

自1975年Frederick Sanger和Walter Gilbert創(chuàng)建DNA測(cè)序技術(shù)以來，DNA測(cè)序飛躍發(fā)展，成為分子生物學(xué)及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的重要研究技術(shù)。Sanger測(cè)序法在測(cè)序量和微量化等方面具有一定的局限性。高通量測(cè)序與單分子測(cè)序技術(shù)相繼涌現(xiàn)，為大規(guī)模測(cè)序提供了技術(shù)支持。

1　高通量測(cè)序技術(shù)

高通量測(cè)序技術(shù)運(yùn)行數(shù)據(jù)量大，可以同時(shí)對(duì)數(shù)百萬個(gè)DNA分子實(shí)施序列檢測(cè)。高通量測(cè)序平臺(tái)主要包括Roche公司/454焦磷酸測(cè)序、Illumina公司/Solexa聚合酶合成測(cè)序及ABI公司/SOLID連接酶測(cè)序。

以Roche/454焦磷酸測(cè)序?yàn)槔摷夹g(shù)的檢測(cè)原理為，第一步把DNA單鏈運(yùn)用PCR進(jìn)行擴(kuò)增與引物雜交，雜交后產(chǎn)物與ATP硫酸化酶、DNA聚合酶、熒光素酶及5’磷酸硫腺苷一起反應(yīng)孵育。此過程中dNTP會(huì)依次加入到引物上。加入的dNTP若與模板配對(duì)便釋放相同數(shù)量的焦磷酸基團(tuán)。ATP硫酸化酶催化焦磷酸基團(tuán)生成ATP，ATP驅(qū)動(dòng)熒光素酶催化熒光素向氧化熒光素轉(zhuǎn)化并發(fā)出與ATP含量成線性關(guān)系的可見光信號(hào)。之后ATP與未反應(yīng)的dNTP及時(shí)被降解。再生的反應(yīng)體系進(jìn)入到下一種dNTP循環(huán)，根據(jù)所得信號(hào)峰值圖可獲得DNA序列信號(hào)。此技術(shù)讀取長(zhǎng)度最長(zhǎng)，但通量最低。當(dāng)測(cè)序遇到多聚核苷酸時(shí)（如AAAAAA）時(shí)，堿基個(gè)數(shù)與熒光信號(hào)強(qiáng)度不再成線性關(guān)系，所以在檢測(cè)具有重復(fù)序列的DNA片段時(shí)具有困難。454焦磷酸測(cè)序法常用的平臺(tái)為GS FLX Titanium sequencing Kit XL+。

Solexa聚合酶合成測(cè)序技術(shù)讀取的片段多，測(cè)序通量高，高度自動(dòng)化，適合大量小片段DNA的測(cè)序。但可逆反應(yīng)時(shí)隨反應(yīng)次數(shù)的增加效率降低、信號(hào)減弱，且讀長(zhǎng)短，從頭測(cè)序具有困難。該技術(shù)廣泛應(yīng)用的測(cè)序平臺(tái)為MiSeq。

SOLiD連接酶測(cè)序每個(gè)堿基讀取兩次，準(zhǔn)確性較高，特別是針對(duì)SNP的檢測(cè)，適合檢測(cè)參考基因序列。在三種測(cè)序技術(shù)中，該技術(shù)測(cè)序讀長(zhǎng)為50bp最短，讀取長(zhǎng)度受反應(yīng)次數(shù)限制。ABI 3730 XL等測(cè)序平臺(tái)被廣泛應(yīng)用。

2　第三代代測(cè)序技術(shù)

第三代測(cè)序技術(shù)指Pacific Bioscience公司的單分子實(shí)時(shí)測(cè)序技術(shù)（SMRT），Helico BioScience公司單分子測(cè)序技術(shù)（TIRM），以及Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)。新一代測(cè)序技術(shù)達(dá)到長(zhǎng)讀取長(zhǎng)度、高通量、低成本的目的。不同于第二代測(cè)序，第三代分子測(cè)序不需進(jìn)行PCR擴(kuò)增，DNA模板與固體表面結(jié)合后邊合成邊測(cè)序。

2.1Pacific Bioscience SMRT技術(shù)

Pacific Bioscience公司的SMRT技術(shù)基于邊合成邊測(cè)序的原理，采用Zero-ModeWaveguide（ZMW零級(jí)波導(dǎo)）。測(cè)序過程為：被熒光標(biāo)記的核苷酸與模板鏈結(jié)合在聚合酶活性位點(diǎn)上（每種脫氧核苷酸由不同顏色染料標(biāo)記），激發(fā)出不同熒光，在熒光脈沖結(jié)束后，被標(biāo)記的磷酸集團(tuán)被切割釋放，聚合酶轉(zhuǎn)移到下一個(gè)位點(diǎn)，下一個(gè)脫氧核苷酸連接到位點(diǎn)上進(jìn)行熒光脈沖，進(jìn)入下一測(cè)序過程。

2.2Helico BioScience TIRM技術(shù)

Helico BioScience公司的基于全內(nèi)反射顯微鏡的測(cè)序技術(shù)——單分子測(cè)序技術(shù)（TIRM）同樣利用邊合成邊測(cè)序的原理，隨機(jī)打斷待測(cè)序列成小分子片段，用末端轉(zhuǎn)移酶在小片段的3’末端添加poly(A)，在poly(A)末端實(shí)施阻斷及熒光標(biāo)記，將小片段與帶有poly(T)的平板雜交，加入聚合酶和被熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸進(jìn)行DNA合成，每循環(huán)一次加入一種dNTP，之后洗脫去除未合成的DNA聚合酶和dNTP，對(duì)Cy3成像，檢測(cè)模板位點(diǎn)上的熒光信號(hào)，對(duì)核苷酸上的染料裂解釋放，加入下一種dNTP和聚合酶，進(jìn)行下一輪循環(huán)。

2.3Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測(cè)序技術(shù)

納米孔測(cè)序技術(shù)的原理不同與前兩種技術(shù)，DNA分子或其堿基從孔洞經(jīng)過時(shí)會(huì)影響固有光信號(hào)和電流。OxfordNanopore納米孔單分子測(cè)序技術(shù)采用α—溶血素構(gòu)建孔洞，核酸外切酶黏附在孔洞外表面，傳感器（環(huán)糊精）結(jié)合到孔洞的內(nèi)表面。之后脂雙分子層包裹納米孔。脂雙分子層兩側(cè)為不同鹽濃度，并提供合適的物理?xiàng)l件。在合適電壓下，核酸外切酶催化斷裂DNA單鏈，堿基進(jìn)入納米孔中，與孔內(nèi)的環(huán)糊精反應(yīng)，影響流過納米孔的固有電流，每個(gè)堿基都能產(chǎn)生特定電流，運(yùn)用該方法可將不同堿基區(qū)分開來。

3　高通量測(cè)序技術(shù)的展望

近年間，高通量測(cè)序被廣泛應(yīng)用到各領(lǐng)域，新一代測(cè)序技術(shù)也取得突飛猛進(jìn)的進(jìn)展，但后續(xù)的海量測(cè)序數(shù)據(jù)分析，以及如何以生物知識(shí)去解釋和應(yīng)用都存在問題。但總體上，新一代測(cè)序技術(shù)的費(fèi)用已大大降低，具有精確度高、速度快、敏感性強(qiáng)等顯著特點(diǎn)。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的飛躍發(fā)展，相信在不久的將來，測(cè)序技術(shù)會(huì)在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮更加重要的作用。

參考文獻(xiàn)：

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作者簡(jiǎn)介：陳怡（1995-），女，漢，本科，河南省永城人，河南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。