利用高通量測序技術篩選地方豬種遺傳特質的研究進展與啟示

文新望

（湖南省益陽市綜合職業中等專業學校，湖南益陽413002）

利用高通量測序技術篩選地方豬種遺傳特質的研究進展與啟示

文新望

（湖南省益陽市綜合職業中等專業學校，湖南益陽413002）

摘要：目前，新一代測序技術已逐漸受到廣大科研工作者的關注和認可，廣泛應用于動植物的遺傳研究和關鍵基因的篩選中，并在篩選我國地方豬種遺傳特質的研究中展現出較強的挖掘能力。本文從當前研究熱點轉錄組和microRNA表達譜出發，綜述了利用高通量測序技術篩選地方豬種遺傳特質的研究進展，以期為評估地方豬種優良種質特性和挖掘優異基因的工作提供參考。

關鍵詞：高通量測序技術；地方豬種；種質特性；遺傳；研究

作者介紹：文新望，女，漢族，湖南益陽人，中教一級職稱，主要從事生物和計算機的教學工作

據統計，我國現有88個地方豬種，是豬種資源最豐富的國家之一。地方豬種根據體型外貌、生產性能、氣候條件等可大致分為華北、華中、華南、西南、江南和高原六個類型［1］，它們所具有的耐粗飼、抗逆性強、肌內脂肪含量高以及繁殖力強等優良種質特性，不僅受到國人的廣泛關注，還對世界豬種改良做出了較大貢獻；同時，它們也是研究豬的特定遺傳性狀的最佳素材。但在外來豬種生長速度較快、瘦肉率較高的優點沖擊下，地方豬種的飼養受到很大影響，其飼養范圍逐步縮小。近年來，地方豬種資源的保護和利用越來越受到政府和社會各界的關注，在健全法律法規、推進開發利用以及建設地方豬保種場等方面的工作取得了突出成效，如頒布實施了《中華人民共和國畜牧法》，建設保種場，劃定保護區，建立基因庫和培育配套系等［2］。與此同時，在科學技術不斷發展進步的情況下，對地方豬種深入開展系統研究，利用分子生物學技術評估優良種質特性和挖掘優異基因也是刻不容緩的一項工作。近年來，新一代測序技術因測序通量高、速度快及測序成本低等優點，逐漸受到廣大科研工作者的關注和認可，廣泛應用于動植物的遺傳研究和關鍵基因的篩選中，并在篩選我國地方豬種遺傳特質的研究中展現出較強的挖掘能力。本文從當前研究熱點轉錄組和microRNA（miRNA）表達譜出發，綜述了利用高通量測序技術篩選地方豬種遺傳特質的研究進展，以期為評估地方豬種優良種質特性和挖掘優異基因的工作提供參考。

1 高通量測序技術簡介

當前的高通量測序技術是指在雙脫氧核苷酸末端終止法（Sanger法）的基礎上發展起來的具有測序通量高、速度快、成本低等優點的第二代測序技術［3］。目前得以廣泛應用的測序技術有三種，即羅氏公司的454技術、Illumina公司的Solexa技術和ABI公司的SOLID技術，三者的原理、數據量產出、數據質量和運行成本均有不同，但其測序步驟大致相當，依次為模板準備、測序和成像、序列組裝和比對等［4］。由于目前測序技術多由各生物信息技術公司提供，本文僅對這三種測序技術做如下簡要介紹。454測序技術是一種依靠生物發光進行cDNA序列分析的技術，在一系列酶的協同作用下使得引物的每一個dNTP聚合與一次熒光信號釋放偶聯起來，通過檢測熒光信號獲得DNA序列，其主要優點為讀段較長，可達600～1 000 bp，但其通量最低［5，6］。Solexa技術的主要原理是邊合成邊測序，利用單分子陣列在小型芯片上進行橋式PCR反應，在采用新的可逆阻斷技術后，合理實現每次只合成一個堿基，其主要優點是測序通量大，結果較為精確，但讀段通常僅為100～200 bp［5，6］。SOLID技術主要采用雙堿基編碼原理，通過寡核苷酸連接和檢測進行測序，盡管其讀段僅為50 bp左右，但測序錯誤率大大降低［5，6］。

2 地方豬種的轉錄組研究

轉錄組是生物體特定組織或細胞在某一特定時間（包括發育狀態或功能狀態）轉錄出來的所有RNA集合。高通量測序技術可將這一RNA集合測序出來以從整體水平研究基因功能，從差異樣品中篩選出差異表達的基因，結合生物信息學技術分析得到調控不同表型的關鍵基因，從而揭示導致不同表型的分子機理。

骨骼肌是動物體內最多的組織，約占體重的40%，其在骨和關節的配合下，通過收縮和舒張，完成各種軀體活動，對其進行發育和種間比較轉錄組研究以揭示分子機理尤為重要。Zhao等［7］采用Solexa測序技術對藍塘豬和長白豬35、49、63、77和91胚齡以及2、28、90、120和180日齡的骨骼肌進行了發育和比較轉錄組研究，在藍塘豬肌肉生成早于長白豬卻慢于長白豬的情況下，共計鑒定出595個差異表達的基因，其中：GSK3B、IKBKB、ACVR1、ITGA和STMN1對后期肌肉的形成具有促進作用，ID1、ID2、CABIN1、MSTN、SMAD4、CTNNA1、NOTCH2、GPC3和HMOX1高表達于藍塘豬的骨骼肌而致使其分化速度減慢。Zhao等［8］采用Illumina Hi-Seq2000對通城豬和大白豬30、40、55、63、70、90和105胚齡及0、7、21和35日齡的骨骼肌進行了轉錄組研究，在通城豬各發育階段骨骼肌中共鑒定出4 331個差異表達基因，而大白豬中僅有2 259個，表明通城豬的骨骼肌發育受到的調控更為復雜；此外，發現CXCL10、EIF2B5、PSMA6和FBXO32在通城豬骨骼肌發育過程中具有重要的調控作用。Xu等［9］對梅山豬65胚齡及3、60和120日齡的骨骼肌進行了轉錄組研究，共計鑒定出338個差異表達的基因，蛋白質譜分析發現66個差異表達的基因，功能分析顯示其功能主要集中于代謝、肌原纖維細絲形成、細胞骨架形成、收縮活動和信號轉導。陳偉［10］比較了280日齡萊蕪豬和大白豬骨骼肌的轉錄組，共計鑒定出10 482個基因表達于二者的骨骼肌中，其中739個基因僅表達于萊蕪豬，差異表達分析發現，98個基因在萊蕪豬中的表達上調，80個下調。趙栓平［11］比較研究了長白豬、通城豬和五指山豬33、65和90胚齡骨骼肌的轉錄組，結果發現長白豬、通城豬和五指山豬中分別有1 402、912和1 910個差異表達基因；三個品種豬中有190個共同的差異表達基因，長白豬和通城豬中有233個共同的差異表達基因，長白豬和五指山豬中有230個共同的差異表達基因，通城豬和五指山豬中有83個共同的差異表達基因。

地方豬種的肌內脂肪含量遠遠高于外來豬種，對二者進行轉錄組研究不僅有利于篩選出調節肌內脂肪含量的關鍵基因，還能深入了解地方豬種高肌內脂肪含量的分子機理。Yu等［12］研究發現藍塘豬背最長肌L*值、肌內脂肪含量顯著高于長白豬，pH45分鐘值、pH24小時值和剪切力值低于長白豬，轉錄組研究共鑒定出586個差異表達的基因，其中267個高表達于藍塘豬，并鑒定出SCD基因可顯著提高多不飽和脂肪酸比率而降低飽和脂肪酸比率。Wu等［13］比較研究了30、90和150日齡的金華豬和長白豬背最長肌的轉錄組，共計鑒定出2 001個差異表達的基因，分析發現調節脂肪酸生成相關基因高表達于金華豬，其中在90日齡的金華豬背最長肌中高表達的pFLJ基因與脂肪沉積相關。此外，脂肪沉積相關基因的篩選也有助于深入了解地方豬種肌內脂肪含量高的分子機理。Xing等［14］比較研究了不同背膘厚度的松遼黑豬的皮下脂肪轉錄組，共計鑒定出188個差異表達的基因，主要富集于脂肪酸合成代謝、脂質合成和脂肪酸代謝過程。Li等［15］比較了脂肪型地方豬和瘦肉型外來豬皮下脂肪組織的轉錄組，結果表明1 596個基因差異表達，其中84個僅表達于地方豬。

此外，包括垂體和乳腺在內的一些地方豬種的腺體發育轉錄組也有相關報道。Shan等［16］對45、120和180日齡的巴馬香豬和45、120和240日齡的藏豬垂體組織進行了轉錄組研究，分別有1 382和1 162個基因僅表達于巴馬香豬和藏豬垂體組織，巴馬香豬中按日齡依次有1 123、64和172個基因高表達，而藏豬依次有1 379、210和132個基因高表達，4個激素基因（GH、PRL、LHB和FSHB）在兩個豬種的各發育時間段均高表達。Zhao等［17］研究了妊娠80、100和110天的母豬乳腺轉錄組，比較鑒定出1 409個差異表達的基因，富集于脂肪酸合成代謝、mTOR信號通路等，其中TP53、ARNT2、E2F4和PPARG對妊娠期乳腺的后期發育具有重要的調控作用。

3 地方豬miRNA表達譜研究

microRNA（miRNA）是一系列長約22 nt的非編碼RNA，它們通過靶向mRNA的3’非翻譯區在轉錄水平調節基因的表達，研究表明細胞過程中的信號轉導、細胞循環、分化和形態轉化中表達的基因，其中大于60%的基因受miRNA直接調節［18］。

在肌肉組織中，Hou等［19］等量混合通城豬18個發育時間點的背最長肌總RNA后，采用Solexa技術鑒定出275個已知的miRNA，新預測出78個miRNA。Zhao等［20］從通城豬33、65、90胚齡和180日齡的骨骼肌中共計鑒定出779個miRNA，差異表達的miRNA達214個。Zhou［21］以90胚齡和120日齡大白豬和二花臉豬雜交后代的骨骼肌中共計鑒定出47個miRNA，其中29個差異表達。

在脂肪組織的研究中，通過比較不同發育階段以及不同品種的miRNA表達譜，鑒定出大量新的miRNA。Li等［22］采用Solexa技術對7和240日齡的榮昌豬背部皮下脂肪組織進行了miRNA表達譜研究，鑒定出227個miRNA，新預測出59個，其中有126個miRNA差異表達。Chen等［23］比較研究了150日齡大白豬和梅山豬背部皮下脂肪組織miRNA表達譜，鑒定出215個差異miRNA，新預測出140個，其中142個差異表達。Li等［24］通過比較藍塘豬和長白豬脂肪組織鑒定出171個miRNA，差異表達的miRNA達48個。

在生殖器官或組織中，Li等［25］采用Solexa技術比較了210日齡藏豬睪丸組織和卵巢組織miRNA表達譜，鑒定出732個miRNA，其中336個共表達于兩個組織，分別有115和222個miRNA僅表達于卵巢和睪丸組織，且24個位于X染色體上miRNA在卵巢中的表達量顯著高于睪丸組織。Liu等［26］比較研究20和210日齡藏豬睪丸組織的miRNA表達譜，鑒定出461個miRNA，新預測出121個miRNA，差異表達的miRNA數量達303個。Lian等［27］采用Solexa技術對30和180日齡軍牧-1豬睪丸組織miRNA表達譜進行了研究，共鑒定出469個miRNA，新預測56個，且有15個miRNA為豬特有，差異表達的數量達122個。

4 篩選地方豬種遺傳特質的方向與啟示

綜上所述，近年來隨著分子遺傳學的迅速發展，地方豬種的種質特性不斷被挖掘。高通量測序技術出現后，使得從整體水平全面解析地方豬種的這些種質特性成為可能，這不僅有利于評估優良種質特性和挖掘優異基因，還能為深入研究基因功能提供理論依據。但是，僅從轉錄組學和miRNA表達譜進行研究，相比于復雜的生理過程，其結果顯得較為單一，且現有數據仍可挖掘出很多有價值的信息，因此，在利用高通量技術挖掘種質特性的遺傳信息時，可以引入蛋白組學和GWAS（全基因組關聯分析）進行多組學研究，達到相互印證的效果，采用多種生物信息學方法深入挖掘現有數據以獲得更多有價值的遺傳信息；此外，對已挖掘出的優異基因進行深入的功能研究也是很有必要的；高通量測序技術這種從整體水平到單個基因功能的研究模式，為其進一步應用于豬遺傳改良、指導輔助育種工作、提高選擇的效率和準確度提供了理論依據。

參考文獻

［1］農業部畜牧業司.全國畜禽遺傳資源保護和利用“十二五”規劃［J］.中國豬業，2012，7（2）：19-22.

［2］于福清.我國地方豬種資源最新狀況與保護利用建議［J］.中國豬業，2012，7（3）：21-23.

［3］閆紹鵬，楊瑞華，冷淑嬌，等.高通量測序技術及其在農業科學研究中的應用［J］.中國農學通報，2012，28（30）：171-176.

［4］岳桂東，高強，羅龍海，等.高通量測序技術在動植物研究領域中的應用［J］.中國科學：生命科學，2012，42（2）：107-124.

［5］張全芳，李軍，范仲學，等.高通量測序技術在農業研究中的應用［J］.山東農業科學，2013，45（1）：137-140.

［6］杜玲，劉剛，陸健，等.高通量測序技術的發展及其在生命科學中的應用［J］.中國畜牧獸醫，2014，41（12）：109-115.

［7］Zhao X，Mo D，Li A，et al. Comparative Analyses by Sequencing of Transcriptomes during Skeletal Muscle Development between Pig Breeds Differing in Muscle Growth Rate and Fatness ［J］. PloS One，2011，6（5）：e19774.

［8］Zhao Y，Li J，Liu H，et al. Dynamic transcriptome profiles of skeletal muscle tissue across 11 developmental stages for both Tongcheng and Yorkshire pigs［J］. Bmc Genomics，2015，16：e377.

［9］Xu Y，Qian H，Feng X，et al. Differential proteome and transcriptome analysis of porcine skeletal muscle during development.［J］. Journal of Proteomics，2012，75（7）：2093-2108.

［10］陳偉.萊蕪豬和大白豬背最長肌miRNA與mRNA轉錄組測序及特征分析［D］.泰安：山東農業大學，2014.

［11］趙栓平.豬骨骼肌生長發育相關基因和microRNA鑒定及其網絡互作分析［D］.楊凌：西北農林科技大學，2012.

［12］Yu K，Shu G，Yuan F，et al. Fatty Acid and Transcriptome Profiling of Longissimus Dorsi Muscles between Pig Breeds Differing in Meat Quality［J］. International Journal of Biological Sciences，2013，9（1）：108-118.

［13］Wu T，Zhang Z，Yuan Z，et al. Distinctive Genes Determine Different Intramuscular Fat and Muscle Fiber Ratios of the longissimus dorsi Muscles in Jinhua and Landrace Pigs［J］. PLoS One. 2013，8（1）：e53181.

［14］Xing K，Zhu F，Zhai L，et al. Integration of Transcriptome and Whole Genomic Resequencing Data to Identify Key Genes Affecting Swine Fat Deposition［J］. PloS One，2014，10（4）：e0122396.

［15］Li XJ，Yang H，Li GX，et al. Transcriptome profile analysis of porcine adipose tissue by high-throughput sequencing.［J］. Animal Genetics，2012，43（2）：144-152.

［16］Shan L，Wu Q，Li Y，et al. transcriptome profiling identifies differentially expressed genes in postnatal developing pituitary gland of miniature pig［J］. DNA Research，2013：1-10.

［17］Zhao W，Shahzad K，Jiang M，et al. Bioinformatics and Gene Network Analyses of the Swine Mammary Gland Transcriptome during Late Gestation［J］. Bioinformatics & Biology Insights，2013，7（7）：193-216.

［18］冉茂良，陳斌，尹杰，等.豬microRNA組學研究進展［J］.遺傳，2014，36（10）：974-984.

［19］Hou XH，Tang ZL，Liu HL，et al. Discovery of microRNAs associated with myogenesis by deep sequencing of serial developmental skeletal muscles in pigs［J］. PloS One，2012，7（12）：e52123.

［20］Zhao SH，Cao JH，Feng Y，et al. Identification of novel regulators in porcine skeletal muscle growth by integrated analysis of miRNA and mRNA expression［A］. In：Plant and Animal Genome XX Conference［C］. 2012. 14-18.

［21］Zhou B，Liu HL，Shi FX，et al. MicroRNA expression profiles of porcine skeletal muscle［J］. Animal Genetics，2010，41（5）：499-508.

［22］Li GX，Li YJ，Li XJ，et al. MicroRNA identity and abundance in developing swine adipose tissue as determined by solexa sequencing［J］. Journal of Cellular Biochemistry，2011，112 （5）：1318-1328.

［23］Chen C，Deng B，Qiao M，et al. Solexa sequencing identification of conserved and novel microRNAs in backfat of large white and Chinese meishan pigs［J］. PloS One，2012，7（2）：e31426.

［24］Li HY，Xi QY，Xiong YY，et al. Identification and comparison of microRNAs from skeletal muscle and adipose tissues from two porcine breeds［J］. Anim Genet，2012，43（6）：704-713.

［25］Li MZ，Liu YK，Wang T，et al. Repertoire of porcine microRNAs in adult ovary and testis by deep sequencing［J］. International Journal of Biological Macromolecules，2011，7（7）：1045-1055.

［26］Liu YH，Ma JD，Chen L，et al. Comparison of microRNA transcriptomes between immature and mature porcine testes［J］. Journal of Animal and Veterinary Advances［J］，2014，13（3）：132-138.

［27］Lian CJ，Sun BX，Niu SL，et al.A comparative profile of the microRNA transcriptome in immature and mature porcine testes using solexa deep sequencing［J］. FEBS Journal，2012，279（6）：964-975.

中圖分類號：S813.9

文獻標識碼：B

文章編號：1673-4645（2016）05-0067-04

收稿日期：2016-03-31