不同應力刺激對成骨細胞影響的研究進展

王大維 王浩 董福生

1.河北醫科大學第三醫院口腔科，石家莊 050051 2.河北醫科大學口腔醫院口腔頜面外科，石家莊 050017

在生長發育過程中，機械應力作為體內復雜力學環境中的重要組成部分，調節著骨組織的形成及改建，尤其在成骨過程中的作用更為明顯。成骨細胞是應力敏感細胞的一種，其生長分化、功能活動及凋亡對骨骼形成與礦化的程度都發揮著重要的調控作用。早在1892年Julius Wolff等[1]就提出了Wolff定律，指出骨骼的生長會受應力刺激而改變結構。Hou等[2]也在小鼠活體實驗中證實，物理刺激可以影響成骨細胞新陳代謝，調節細胞表型，并改變成骨細胞在骨發生及發展中的基因表達。骨組織對機械應力刺激的應答過程可劃分為4個連續的過程，即力學偶聯過程、生化偶聯過程、信號傳遞過程、效應細胞的反應過程。應力刺激作用于機體時，成骨細胞通過力學刺激應答過程將物理信號轉化為細胞內的生物化學信號，經過一系列復雜的信號傳導過程，改變成骨細胞的基因表達及蛋白分泌，進而調控骨骼的生長、修復及改建。本文從不同應力刺激對成骨細胞功能的影響、成骨細胞對外力刺激的應答及信號傳導通路等方面作一綜述。

1 不同應力刺激對成骨細胞功能的影響

目前研究不同應力刺激對成骨細胞功能的影響，常見的應力加載方式有牽張力、壓應力及流體剪切力等。不同的應力加載方式和裝置會對成骨細胞產生不同的應力效果。

1.1 牽張力對成骨細胞功能的影響

在體內，成骨細胞可分泌基質包裹自身，外力通過對此基質的形變刺激傳導給細胞骨架，這些外力導致基質的變形，在骨陷窩及骨小管周圍對成骨細胞形成拉力。目前多數體外培養成骨細胞的牽張力加載裝置是基于此原理[3]。通過模仿生理狀態下基質的形變，采用不同方法牽拉培養基膜，使粘附于基膜上的成骨細胞被動拉伸。近年來許多學者對牽張力加載裝置進行了改進，如改用鈦合金作為支架、使用彈性合適的硅膠或生物高分子材料等，并可調控刺激的大小、方向、頻率、周期等[4]，但此種裝置仍有其缺點，細胞受力大小取決于基質與基底膜的接觸，培養基膜各區域細胞容易產生受力不均勻等情況，而且體外培養基膜的應變明顯大于骨基質，且單軸牽拉時，牽拉軸的垂直方向可對細胞產生收縮壓力。周期性培養基膜屈曲形變時，若屈曲率過大則產生流體剪切力，增加干擾因素。

成骨細胞對牽張應力的作用很敏感。牽張刺激會激發成骨細胞的分化和增殖潛力，還可以刺激成骨細胞通過調整縫隙連接或旁分泌因子來調節成骨細胞[5-6]。此外，由于多孔微管特殊結構的放大效應，成骨細胞可感應到牽拉應力并傳遞至臨近細胞[7]。在日常生活及運動中，機體內牽張力范圍大約為500～3000 με。唐麗靈等[8]對成骨細胞施加周期性拉伸刺激，發現500 με的拉伸刺激促進了成骨細胞的增殖、膠原蛋白合成、堿性磷酸酶活力和骨鈣素分泌，而1000 με和1500 με水平的拉伸則抑制了成骨細胞的生長和分化能力。Jacobs等[9]利用不同大小靜態拉力分別刺激人牙周膜成纖維細胞及成骨細胞，認為合適大小的牽張力可促進人牙周膜成纖維細胞向成骨細胞的分化，過高的牽張力則會導致成骨細胞活力降低，不利于骨的改建。Shen等[10]的實驗也發現周期性牽張力可促進牙周膜干細胞向成骨細胞分化。這些研究表明，只有合適大小及頻率的牽張力才能促進成骨細胞增殖、分化，促進骨的生長、修復和改建。

1.2 流體剪切力對成骨細胞功能的影響

骨組織內存在大量的微管結構，外界應力可引起微管內液體流動，形成流體剪切力。可以說，剪切力是一種特殊形式的壓力。目前廣泛使用的流體剪切應變模型為并行平板流動室(parallel-plate flow chamber，PPFC)，它是一種可以提供較精確液體層流的實驗裝置，利用進出口的壓力梯度造成流體剪切力，常用于研究細胞流體力學[11]。但是傳統的平行平板流動室系統仍存在操作復雜、加工價格較貴、處理細胞的數量不足等缺點，且如何提供細胞在加載中所需要的溫度、濕度、CO2分壓等問題尚未能解決。2010年Zhou等[12]提出了一種全新的模擬流體剪切力的加載方式—“搖晃法”加載系統。他們構建了一個有節律的搖晃矩陣培養板模型給細胞定量加載流體剪切力，并利用數學模型確定了臨界翻轉角度以及所產生流體剪切力的理論數值。其力值大小與液體的粘稠度和最大搖擺角成正比，與矩陣內液體的深-長比和搖擺周期成反比。Zhou等認為，在這種上下搖晃的系統中，只要控制得當，模型中細胞所受流體剪切力差異將少于20%。此種加載方式優點在于簡便易行，可處理大量細胞，便于激光共聚焦顯微鏡或原子力顯微鏡的原位觀測，且其產生的動態剪切力能更好地模擬活體組織中的力學環境。

但Zhou等并未將此裝置應用于實際，沈等[13]利用此裝置對成骨細胞進行了加載。他們將生長活躍期的成骨細胞以5×105個/ml的密度接種在矩形培養皿中，待細胞貼壁后，于超凈臺上將培養皿放置于CHA-S恒溫振蕩器上，設定晃動頻率和幅度，保持晃動時培養液與培養皿底面的角度不超過±5°，頻率為120 r/min。加載液(DMEM培養基)的量為18.6 ml時，根據Zhou等提出的培養皿中心處的流體剪切應力公式計算，培養皿中84%區域的細胞將受到6.2～8.8 dyne/cm2的流體剪切應力。通過與平行平板流動室結果的比較，沈等認為，“搖晃法”更適用于：(1)多組別、大通量的細胞加載研究；(2)加載后對細胞內極微量的細胞因子進行定量檢測；(3)需要對加載后的細胞進行原位觀測的情況。此外，Lim等[14]也利用“搖晃法”成功誘導了牙槽骨間充質干細胞向成骨細胞的分化。

越來越多的證據表明，在機械外力加載后，由于胞外液體在微管結構中流動產生的流體剪切力，是調節骨細胞新陳代謝的主要外界刺激。Burger等[15]提出的腔隙-小管網絡結構的假說，認為骨組織中腔隙-小管構成的三維網絡執行骨中力學傳感和力學信號轉導功能，剪應力是外在力學刺激傳感到骨組織細胞的主要作用形式。成骨細胞在體內及體外實驗中均可受流體剪切力的作用，動態的流體剪切力可促進成骨細胞分化增殖，抑制成骨細胞凋亡[16]。Qin等[17]研究表明，骨髓內震蕩壓力產生的流體剪切力及流體靜壓力可促進骨生成，Zhang等[18]的動物實驗也證實了這一點。Li等[19]實驗顯示流體剪切力能夠提高骨密度。Young等[20]則進一步提出，流體剪切力是通過誘導COX-2的表達，調節PG的產生，從而影響骨新陳代謝的整個過程。而Jiang等[21]認為ERK5信號通路是誘導COX-2表達的重要途徑。Aisha等[22]也發現流體剪切力可明顯促進人體成骨細胞內線粒體的代謝和增殖，防止細胞凋亡，促進ALP活性及骨鈣素蛋白增加，且細胞內RANKL/OPG的比值降低，提示流體剪切應力可抑制破骨細胞活性。

1.3 壓應力對成骨細胞功能的影響

目前關于壓應力對成骨細胞功能的影響相對研究較少。早期研究壓應力對成骨細胞功能的影響主要為靜態壓應力。Koyama等[23]的研究顯示，3.0 g/cm2的持續靜壓力可促進成骨細胞釋放炎性細胞因子，誘導破骨細胞的骨吸收。Quinn等[24]認為持續的靜態壓力使細胞與培養基內可溶物質交換減慢，導致細胞代謝功能的減退。在正常生理情況下，骨組織在受力過程中因運動、重力等多種因素影響，位于骨組織表面、骨內外膜下的成骨細胞同時也受到持續不規則的力學刺激，因此持續性動態壓力對成骨細胞的代謝及成骨作用有重要影響。Liu等[25-26]認為動態壓力可誘導間充質細胞的早期成骨分化，促進骨組織礦化及細胞的增殖。Damaraju等[27]認為動態壓力可以加速成骨細胞分化，促進成骨細胞的聚集。Sanchez等[28]也認為動態壓力可使細胞內IL-6水平升高從而調控骨的生成。

目前對于壓力的加載方式主要為氣壓調控，也有部分實驗采用離心作用，對成骨細胞進行離心加載，來模擬運動過程中骨所受壓力，此種加力方式優點是力值穩定，方向一致，可靠性好，不損傷細胞，可以多次重復進行，但在離心過程中細胞由于離心力加載時細胞并不處于統一的離心半徑，因而其應用存在一定局限性。近年出現的Flexcell壓力系統能為各種組織、三維細胞培養物提供壓力加載，其具備多種優點，如可以提供周期性動態壓力；實時觀察細胞及組織在壓力作用下的反應；基于柔性膜基底變形受力均勻；加載頻頻率、形變率可以精確調節；操作簡便等，是以后研究壓力對細胞功能影響的較理想裝置。

2 成骨細胞對外力刺激的應答及信號傳導通路

早在20年前，Duncan和Turner[29]就已經將細胞內感受機械應力的過程總結為4個階段：第一步為力耦合，即將骨組織受到的機械應力傳遞至細胞中，造成細胞外形的改變，或使骨基質中間隙液流動加快，造成流動電勢，并使顯露于液流中的細胞受到剪切力的影響；第二步為力傳導，即將加載于細胞上的機械信號轉換為細胞內的化學或電學應答的過程；第三步為信號傳導，包括蛋白激酶級聯系統、G蛋白系統、力學特異敏感性離子通道、細胞間隙連接、第二信使系統等；最后一步是細胞發生生理反應或功能變化，完成力學刺激對細胞的作用過程。成骨細胞作為骨組織中的應力敏感細胞，在感受到外界力學刺激時，會通過多種信號傳導通路將機械信號轉化為生物化學信號，通過細胞內信號的傳導到達效應位點，從而刺激成骨細胞的功能活動。由于應力刺激導致的細胞因子改變是此過程中的關鍵，因此對信號傳導通路的研究是目前的熱點，其中BMPs及Wnt/β-catenin信號通路作為重要的通路而被廣泛研究。

2.1 BMP2-smad5-Runx2傳導通路在成骨細胞感受外力刺激中的作用

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP) 是多功能生長因子，其在骨組織中表達，為維持骨代謝平衡所必需，在骨骼發育和骨折愈合中發揮重要的作用，是一個極其重要的調節蛋白家族。骨形態發生蛋白除 BMP1 外均屬于TGF-β超家族。在迄今發現的約20多種BMPs成員中，以BMP-2、BMP-4和 BMP-7的活性最強。BMP2是BMPs家族中非常重要的一個亞型，可以刺激間充質干細胞向成骨細胞分化，并促進成骨細胞分化為骨細胞。

BMPs與其受體BMPR結合，通過蛋白傳遞信號促進成骨細胞分化，其中Smad-RunX2是BMPs向細胞內傳遞信號的主要通路之一[30]。Bjoern等[31]認為適當的活動或壓力刺激可通過增強骨生成效應促進骨折的愈合，10%的壓力[(11.81±0.42) kPa]可促進BMP-2、smad-5、RunX2的表達，從而進一步促進ALP、COL1、OC、OPN等基因及蛋白的表達。Mitsui等[32]實驗也證明了應力可促進BMP蛋白的表達，并確定了一個最佳的通過BMP通路成骨的作用力，來指導正畸臨床工作。Wang等[33]也認為，拉應力通過BMPs-Smad信號通路促進成骨細胞分化，并可能是通過降低Smurf1來促進Smad蛋白聚集，從而激活BMPs-Smad信號傳導通路。

2.2 Wnt/β-catenin信號通路在成骨細胞感受外力刺激中的作用

Wnt 基因于1982年由Nusse等發現[34]，其編碼的Wnt蛋白具備分泌型生長因子的特點，研究發現其能夠在應力作用下通過自分泌的方式對成骨細胞發揮作用[35-36]。在成骨細胞中，Wnt蛋白參與了4 條信號通路，即 Wnt/β-catenin信號通路、平板細胞極性信號通路、Wnt/Ca2+信號通路、含環磷酸腺苷 (CAMP) 效應元件結合蛋白的蛋白激酶A(PKA)信號通路[37]，其中Wnt/β-catenin信號通路即經典信號通路研究最為成熟。細胞內分泌的Wnt配體通過細胞表面受體Fzd家族與LRP5/LRP6受體結合形成復合物，受體復合物引起β-catenin在細胞內的積累，從而傳導信號至細胞內。Norvell等[38]發現流體剪切力刺激可以激活 Wnt/β-catenin 信號通路從而影響成骨細胞的分化。Robinson 等[39]發現體內及體外加載應力刺激都能夠促進β-catenin 蛋白的表達，且Wnt/β-catenin信號通路可增加成骨細胞對機械力刺激的敏感性。Liu等[40]認為，流體靜壓力可促進Wnt蛋白表達，且應力可能是通過ERK通路促進Wnt10b表達。Jansen 等[41]的研究顯示，15 min的周期性拉伸應力在實驗初期可以促進前成骨細胞內β-catenin 蛋白的表達，但在結束周期性加載12 h和40 h后β-catenin 蛋白的表達明顯減少。另有研究發現[42]，在成骨作用中PTH與Wnt信號通路相關，主要表現在：即使細胞內有Dkk1過表達，PTH仍可激活Wnt信號通路，而如用Dkk1抑制Wnt信號通路則會減弱PTH在基質細胞中的作用且會抑制新骨的形成，PTH要發揮全部功能需要完整的Wnt信號通路。目前，雖然人們對Wnt/β-catenin信號通路在應力作用下影響成骨細胞分化的機制有了初步認識，但由于Wnt信號通路并不是單一的通路，而是與其他相關通路形成復雜的網絡，因此在今后研究中應著重探究Wnt/β-catenin信號通路和其他通路的交聯作用。

3 展望

骨生理學的研究已經進入細胞與分子生物學研究時代，成骨細胞作為骨組織中骨形成、骨改建調節和骨細胞來源的細胞群體，是參與骨代謝，維持正常骨量的重要功能細胞。隨著相關學科及實驗技術的不斷發展，應力刺激對成骨細胞的作用逐漸成為了目前的研究熱點。近年來，人們通過不斷改進實驗裝置、更新實驗方法，對不同應力刺激下成骨細胞的反應有了初步的研究成果，但其具體機制仍不甚清晰，且由于各加載方案在條件控制、細胞來源、應力性質、頻率、大小等方面的差異，其所得結果也不盡相同，有待進一步研究。

本文主要總結了不同應力對成骨細胞的影響。由于骨細胞較成骨細胞對應力更為敏感，所以研究不同應力刺激對骨細胞的影響、力學刺激如何在細胞內轉變為生物學信號以及通過何種結構或部位做出生物學反應，是以后研究的方向和重點。