兩種結核病病原菌快速檢測技術的效果比較

辛寶林 于秀坤

（大慶市疾病預防控制中心，黑龍江 大慶 163311）

兩種結核病病原菌快速檢測技術的效果比較

辛寶林 于秀坤

（大慶市疾病預防控制中心，黑龍江 大慶 163311）

目的 探討環介導等溫擴增法與膠體金免疫層析法在結核病病原菌快速檢測效果比較。方法 選擇2013年10月至2015年5月于我中心就診的71例疑似結核病患者，分別取痰樣本和血樣本各71份，痰樣本分別采用環介導等溫擴增法和羅氏固體培養法進行病原菌檢測。血樣本采用膠體金免疫層析法進行病原菌檢測。以羅氏固體培養法結果為參照，評價環介導等溫擴增法和膠體金免疫層析法診斷的準確性。結果 以羅氏固體培養法結果為參照，環介導等溫擴增法的靈敏度為90.32%，特異度為97.50%，準確率為95.77%；膠體金免疫層析法靈敏度為97.10%，特異度為100%，準確率為94.37%。結論 膠體金層析法和環介導等溫擴增法均可獲得較為滿意的診斷結果，臨床上可根據患者癥狀選擇不同的診斷技術。

結核病；結核分枝桿菌；快速檢測；免疫層析法；核酸擴增技術

結核病是由結核分枝桿菌感染引起的局部組織肉芽腫和免疫反應的一種疾病。我國結核發病人數較高，位居世界第2位。結核病的診斷和治療進展對提高我國人民健康水平有重要意義。結核病診斷的金標準為培養法，但耗時較長，即便采用較為先進的培養技術，也至少需要2周才能確診，等待結果后再制定治療方案會貽誤病情，經驗性治療方案又容易造成結核分枝桿菌耐藥。故快速診斷對結核病的治療有重要影響。目前結核病快速診斷手段較多，包括涂片法、膠體金法、環介導等溫擴增法、干擾素釋放試驗、核酸探針檢查法及PCR檢測法等[1]。而前3者的應用因操作簡單便捷更為廣泛。涂片法準確率低，已不能滿足人們的需求。本研究納入自2013年10月至2015年5月于我中心就診的71例疑似結核病患者，分別取痰樣本和血樣本各71份，痰樣本分別采用環介導等溫擴增法和羅氏固體培養法進行病原菌檢測，血樣本采用膠體金免疫層析法進行病原菌檢測，旨在分析兩種常見的結核病病原菌快速檢測技術優缺點，報道如下。

1 資料與方法

1.1 樣本來源：選擇2013年10月至2015年5月于我中心就診的71例疑似結核病患者。納入研究的患者年齡15～63歲，平均年齡（43.2±

10.6 ） 歲，病程3個月～2年。均為初次就診。痰樣本于清晨深部咯出，分成2份分別用于環介導等溫擴增法和羅氏固體培養法檢查。血樣本于清晨自肘靜脈取血5 mL，不抗凝處理，用于膠體金免疫層析法檢查。

1.2 羅氏固體培養法：將等體積的4%氫氧化鈉溶液加入到痰樣本中，采用渦旋振蕩器震蕩20 s使其均勻化，室溫下靜置15 min后，于培養基斜面上接種0.1 mL樣本，放置于37 ℃培養箱中孵育。接種3周后開始每周觀察1次，8周內發現菌落生長，視為結核分枝桿菌培養陽性，反之則否。

1.3 環介導等溫擴增法：將等體積的2.96%檸檬酸三鈉和4%氫氧化鈉混合液加入到痰樣本中，采用渦旋振蕩器震蕩20 s使其均勻化，室溫下靜置15 min，以12 000 r/min的速度離心10 min，將上清液棄掉，生理鹽水洗滌沉淀，并再次以12 000 r/min的速度離心10 min、棄上清液。在沉淀中加入200 μL的裂解液（2 mM EDTA、0.6%Triton-X100、20 mM pH8.0 Triso HCl），渦旋振蕩器震蕩20 s，沸水浴20 min，冷卻，再經12 000 r/min的速度離心10 min，取上清液30 μL，放入反應試管中，60～65 ℃下加熱60 min，加熱器滅活反應試管中的酶，80 ℃下加熱5 min。用紫外照射燈光照射對結果進行判讀。肉眼觀察到綠色熒光則為陽性，橙色則為陰性。

1.4 膠體金免疫層析法：血樣本用于膠體金免疫層析法。結核分枝桿菌抗體診斷試劑盒由上海奧普生物醫藥有限公司提供。血樣本經離心處理后獲得血清樣本，備用。在反應孔中間先加入封閉液兩滴，薄膜吸入后加血清樣本40 μL，薄膜吸入后加入洗活液6滴，薄膜吸入后金標液2滴。結果判讀需在60 s內完成，質控線和檢測線均出現紫紅色條帶為陽性，僅有質控線出現紫紅色則為陰性。

1.5 統計學方法：采用SPSS19.0進行數據的整理和統計。以羅氏固體培養法結果為參照，計算其他2種檢查方法的靈敏度、特異度及準確率。2種方法均與羅氏固體培養法進行配對卡方檢驗（McNemar’s test）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

羅氏固體培養法結果為陽性43.66%（31/71），環介導等溫擴增法結果為陽性40.85%（29/71），膠體金免疫層析法結果為陽性39.44%（28/71）。以羅氏固體培養法結果為參照，環介導等溫擴增法的靈敏度為90.32%（28/31），特異度為97.50%（39/40），準確率為95.77%（68/71），配對卡方檢驗得P=0.5637，差異無統計學意義（P＞0.05）；膠體金免疫層析法靈敏度為97.10%（27/31），特異度為100%（40/40），準確率為94.37%（67/71），P=0.0833，差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

膠體金法的原理是通過測定結核菌特異性外分泌蛋白MPB64確定診斷，操作簡便、快速、重復性好，3 min即可完成操作，對結核菌的檢出率高于涂片法。但由于結核菌的幾個亞株不產生MPB64，膠體金法會顯示假陰性，故在結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的鑒定上存在一定的局限性[2]。而對于免疫反應強的陳舊性肺結核患者，靜止期時抗結核抗體可能持續一定的滴度[3]，故此時結果陽性只能說明患者曾有感染史，不能確定病情處于活動期。膠體金免疫層析法有4例誤判為陰性，其可能為不產生MPB64的結核菌。就整體而言，膠體金免疫層析法靈敏度為97.10%，特異度為100%，P=0.0833，提示膠體金免疫層析法可獲得較好的診斷效果。

環介導等溫擴增技術是分子生物學診斷技術中的一種。其通過設計特定的引物可與結核分枝桿菌中DNA gry B和IS6110等區域相互識別，其特異性高，擴增效率高，時間短產物量大[4]。與其他分子生物學診斷技術相比，環介導等溫擴增技術不需要昂貴的實驗器材，應用一種酶即可進行擴增[5]，對實驗室要求不高，更適合在臨床推廣。整個檢測程序在2 h內即可完成。本研究結果顯示環介導等溫擴增法的靈敏度為90.32%，特異度為97.50%，準確率為95.77%，配對卡方檢驗得P=0.5637。提示與膠體金免疫層析法比較，環介導等溫擴增技術操作相對復雜，但其一致性高。

綜上所述，膠體金層析法和環介導等溫擴增法均可獲得較為滿意的診斷結果。臨床上如如癥狀較為典型，可采用膠體金免疫層析法給予快速確診，如癥狀不典型，且不能區分結核分枝桿菌感染和非結核分枝桿菌感染時，推薦選擇環介導等溫擴增法。

[1] 陳琪,張軒,許紅芳,等.結核分枝桿菌快速檢測方法研究進展[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(6):703-704.

[2] 白廣紅,李耀軍,焦向陽,等.膠體金法快速檢測結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌的研究[J].國際檢驗醫學雜志,2013,34(10):1274-1276.

[3] 黃勝,余繼英,趙春艷,等.膠體金法檢測結核抗體的臨床價值探討[J].臨床肺科雜志,2014,19(6):1058-1060.

[4] 于霞,梁倩,馬異峰,等.環介導等溫擴增技術快速檢測痰液標本中結核分枝桿菌的初步評價[J].中國實驗診斷學,2013,17(5):846-849.

[5] 黃曙海,譚慧媚,戴廣明,等.LAMP技術檢測結核分枝桿菌試驗性研究[J].應用預防醫學,2011,17(1):1-4.

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1671-8194（2016）34-0073-02