制備液相色譜法分離純化恩拉霉素預(yù)混劑中恩拉霉素A和恩拉霉素B

唐陽剛* 李敬輝徐新軍黃潔云

（1 麗珠集團新北江制藥股份有限公司，廣東 清遠 511500；2 中山大學藥學院，廣東 中山 510000）

制備液相色譜法分離純化恩拉霉素預(yù)混劑中恩拉霉素A和恩拉霉素B

唐陽剛1* 李敬輝1徐新軍2黃潔云2

（1 麗珠集團新北江制藥股份有限公司，廣東 清遠 511500；2 中山大學藥學院，廣東 中山 510000）

目的 建立從恩拉霉素預(yù)混劑中分離純化恩拉霉素A和恩拉霉素B的制備高效液相色譜（Pre-HPLC）方法。方法 采用正丁醇與酸水反復(fù)萃取，利用Pre-HPLC方法對恩拉霉素精制品中的恩拉霉素A和恩拉霉素B進行分離純化。結(jié)果 用紫外、質(zhì)譜和核磁共振法進行結(jié)構(gòu)確證，經(jīng)分析型HPLC檢查，恩拉霉素A和恩拉霉素B的純度均達98.0%以上。結(jié)論 由該法制備恩拉霉素A和恩拉霉素B簡便、快速，所得產(chǎn)物純度高，適合于其對照品的制備。

恩拉霉素；制備液相色譜法；分離純化；恩拉霉素A；恩拉霉素B

恩拉霉素（enramycin）又名安來霉素、恩霉素、持久霉素，是一種由鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的多肽類抗生素，已被世界上許多國家正式批準為抗生素飼料添加劑［1-3］。作為飼料添加劑，恩拉霉素具有優(yōu)良的促生長和改善飼料利用率的作用，同時具有穩(wěn)定性高，腸道內(nèi)不易降解，無交叉耐藥性，無殘留等優(yōu)點。在當前食品安全事件頻發(fā)的情況下，恩拉霉素因其廣譜、高效和安全而引起人們的關(guān)注［4-5］。

恩拉霉素是一種由氨基酸分子和脂肪酸分子組成的有機堿類，其中氨基酸分子組成環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)，脂肪酸分子位于多肽結(jié)構(gòu)末端。由于脂肪酸分子的不同，得到A、B兩種組分，恩拉霉素即為這兩種組分的混合物。恩拉霉素A和恩拉霉素B結(jié)構(gòu)非常相似，難于分離制備，目前國內(nèi)尚無恩拉霉素A、恩拉霉素B對照品，恩拉霉素的研究及質(zhì)量控制、監(jiān)督管理中所需對照品依賴進口，價格昂貴。本實驗通過采用反相高效制備液相色譜從恩拉霉素中分離純化得到恩拉霉素A和恩拉霉素B，為產(chǎn)品的質(zhì)量控制、質(zhì)量監(jiān)督、測試方法評價、化學量制溯源提供參考。

1　儀器和試劑

SHIMADZU HPLC儀，含SIL-20A型進樣器，SPD-20A紫外檢測器，LC-20AT泵，LC solution工作站（日本島津公司）；Mettler toledo AL-204萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；SB25-12DTD型超聲清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-16B安科離心機（上海安亭科學儀器公司）；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Bruker Autoflex Ⅲ smartbean基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀（德國BRUKER公司）；Bruker AV600超導核磁共振波譜儀（德國BRUKER公司）。

8%恩拉霉素預(yù)混劑（批號：1101002，麗珠集團新北江制藥股份有限公司），乙腈、甲醇（B&J）為色譜純，水為Milli-QRG純水系統(tǒng)制備的超純水（美國Millipore公司）。乙醇、正丁醇、乙醚、磷酸二氫鈉、鹽酸、氫氧化鈉（天津大茂）均為分析純。

2　方法和結(jié)果

2.1樣品制備：取8%的恩拉霉素預(yù)混劑約100 g，加入500 mL的60%乙醇攪拌均勻，用2 mol/L HCl（約90 mL）調(diào)pH至3，超聲提取30 min，減壓過濾。在濾液中加入約2 g活性炭后于水浴中煮沸15 min脫色，過濾除去活性炭，將濾液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至無醇味（約300 mL），將濃縮后的溶液用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至8，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，用水飽和的正丁醇萃取，每次100 mL，萃取3次，合并正丁醇層，用100 mL水洗正丁醇層，重復(fù)操作一次。正丁醇層用100 mL pH為3的稀鹽酸水進行反萃取，同法共萃取3次，合并酸水層，用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)所得酸水層pH至7.5～8，加100 mL水飽和的正丁醇萃取，重復(fù)3次，再用100 mL正丁醇飽和的水洗正丁醇層2次，將水洗后的正丁醇層減壓濃縮至小體積，加入100 mL乙醇共沸脫水，向脫水后的樣品中加入20 mL乙醚，放置于冰箱過夜，離心后得到類白色無定形沉淀，40 ℃減壓干燥12 h得類白色粉末作為供試品。

2.2色譜條件

2.2.1制備型HPLC。色譜柱：GRACE-Apollo C18（150 mm×10 mm，5 μm）；流動相：甲醇（B）-0.5%醋酸（A）（35∶65，v/v）；流速：4 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：1 mL；檢測波長：267 nm。

2.2.2分析型HPLC。色譜柱：Phenomenex Luna C18（200 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（B）-0.05 mol/L磷酸二氫鈉（A）（30∶70，v/v）；流速1 mL/min；柱溫：室溫；進樣量：10 μL；檢測波長：267 nm。

2.3純品的制備：取恩拉霉素樣品約1 g，用15 mL pH=3的50%甲醇超聲5 min，經(jīng)4000 r/min離心，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液進樣，進行高效液相制備色譜分離，按上述制備色譜條件洗脫，收集7.8～9.5 min和14～16 min兩段組分。

2.4制備組分的純度檢查：取收集的兩份制備組分溶液按“2.2.2”項下分析HPLC條件進樣，經(jīng)面積歸一化法計算，化合物A的純度為99.23%，化合物B的純度為98.86%。將純度大于98%的經(jīng)化合物A和化合物B分別以40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮至干，用甲醇超聲溶解，過濾，置于真空干燥箱內(nèi)40 ℃減壓揮干，最后得到2種類白色粉末。

2.5結(jié)構(gòu)鑒定。化合物A：類白色粉末，UV（MeOH）λmax nm：231，272 nm；質(zhì)譜［MALDI-TOF/MS（m/z）］：m/z為：2355.891；其UV、MS與恩拉霉素A文獻報道［7］一致。化合物B：類白色粉末，UV（MeOH）λmax nm：231，272nm；質(zhì)譜［MALDI-TOF/MS（m/z）］：m/z為：2369.945；，其UV、MS與恩拉霉素B的文獻報道［7］一致。

3　討 論

3.1由于樣品為預(yù)混劑，含大量發(fā)酵用培養(yǎng)基及敷料，因此需要進行必要的前處理，根據(jù)恩拉霉素易溶于酸水，調(diào)整堿性后溶于水飽和正丁醇這一性質(zhì)，試驗中采用正丁醇與酸水反復(fù)萃取的方法獲得以恩拉霉素A和恩拉霉素B為主的樣品。

3.2高效制備液相色譜法分離制備化合物不僅能夠得到高純度的化合物單體，而且產(chǎn)率高，操作方便，便于收集，制備出的產(chǎn)品可作為對照品。該色譜分離方法為在抗生素中分離高純度的化合物單體提供了參考。

［1］Higashide E，Hatano K，Shibata M，et al.Enduracidin，a New Antibiotic I，S treptom yces fungicidicus No.B5477，an Enduracidin Producing Organism［J］.Antibiotics，1968（21）：126-137.

［2］Asai M，Muroi N，Sugita H，et al.Enduracidin，a New Antibiotic II.Isolation and Characterization［J］.Antibiotics，1968（21）：138-146.

［3］顧欣，蔡金華，劉雅妮，等.飼料中恩拉霉素的微生物學含量測定方法研究［J］.中國獸藥雜志，2008，42（9）：17-21.

［4］卜仕金.多肽類抗生素飼料添加劑——安來霉素［J］.中國獸醫(yī)雜志，2003，39（4）：48-50.

［5］萬文倩，楊文革，胡永紅.微生物檢測法 測定安來霉素發(fā)酵液生物效價［J］.飼料檢測，2010（3）：41-43.

［6］周岷江，嚴玉寶，胡娟，等.恩拉霉素的研究進展［J］.中國獸藥雜志，2007，41（12）：42-44.

［7］黃萍，萬有能，鄧紅，等.恩拉霉素在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用進展［J］.四川畜牧獸醫(yī)，2010（10）：29-30.

R917

B

1671-8194（2016）26-0022-02

2012年清遠市產(chǎn)學研結(jié)合項目（項目編號：2012D021211001）

E-mail： tangyanggang@livzon.cn