干細胞誘導分化為肝樣細胞檢測技術的研究進展

唐 靜唐 偉謝明均*

（1 四川醫科大學，四川 瀘州 646000；2 游仙區人民醫院，四川 綿陽 621004；3 宜賓市第一人民醫院，四川 宜賓 644000）

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干細胞誘導分化為肝樣細胞檢測技術的研究進展

唐 靜1唐 偉2謝明均3*

（1 四川醫科大學，四川 瀘州 646000；2 游仙區人民醫院，四川 綿陽 621004；3 宜賓市第一人民醫院，四川 宜賓 644000）

【摘要】用于終末期肝病治療的干細胞療法是基礎及臨床研究的熱點。而對干細胞誘導的肝樣細胞進行肝細胞生物學功能檢測是干細胞治療的重要步驟。肝樣細胞檢測技術眾多，需從中選出特異性強、靈敏度高、對細胞或機體影響小、方法簡單易行的檢測技術。本文通過對干細胞誘導分化的肝樣細胞檢測技術作一綜述，為后期的實驗提供一定的理論基礎。

【關鍵詞】干細胞；誘導；肝樣細胞；檢測

肝臟在機體中參與消化、代謝、免疫等生理過程。毒素、感染等因素可引起嚴重肝細胞損害，導致其合成、解毒、排泄和生物轉化等功能發生嚴重障礙，最終發展至終末期肝病，嚴重威脅人類健康。原位肝移植是終末期肝病的有效治療手段，但供肝緊缺及排斥反應限制了它的應用。干細胞是一類具有自我復制和多向分化潛能的細胞群體，在合適的條件下，可分化為具有特征性形態、特異分子標志和特殊功能的成熟細胞，如肝細胞、神經細胞、骨骼肌細胞、軟骨細胞、血管內皮細胞、肺上皮細胞以及胰島樣細胞等[1]。

如今可通過向培養基中加入可溶性因子，如肝細胞生長因子（HGF）、成纖維細胞生長因子（FGF）、轉化生長因子（TGF）等[2-3]，使干細胞向功能性肝樣細胞分化。這些與細胞因子作用后表達的肝細胞特異性標志物可通過多種技術檢測，而優選出特異性強、靈敏度高、對細胞或機體影響小、方法簡單易行的檢測技術是干細胞治療的重中之重。本文通過對干細胞誘導分化為肝樣細胞的檢測技術作一綜述，以尋求能高效檢測肝樣細胞的技術，保證誘導分化的肝樣細胞在合成、代謝功能等方面對原代肝細胞進行替代，使得干細胞治療安全、有效的應用于科研及臨床。

1 干細胞誘導分化為肝樣細胞的檢測技術

1.1 RT-PCR：RT-PCR即逆轉錄-聚合酶鏈反應，是指對組織或細胞的的總RNA進行提取，把RNA反轉錄為cDNA，然后設計目的基因引物進行PCR，瓊脂糖電泳并數碼拍照，分析電泳條帶灰度值，判斷目的基因mRNA轉錄水平的相對量的變化。Robert E等[4]，Simon等[5]應用RT-PCR技術對干細胞誘導后細胞的AFP、ALB 、CK-18、G6PC、

1.2 Western Blot：Western Blot是根據抗原抗體的特異性結合檢測樣品中的特定蛋白的方法。其采用的是PAGE（聚丙烯酰氨凝膠電泳），經PAGE分離的蛋白樣品，轉移到固相載體，固相載體與蛋白質以非共價鍵連接，以連接的蛋白質或多肽作為抗原，與相應的特異性抗體結合，再與酶或同位素標記的二抗反應，對底物顯色或放射自顯影，通過分析著色的位置和著色深度了解特定蛋白質在所分析的細胞或組織中表達情況。Huang等[6]應用該技術在臍帶干細胞誘導的肝樣細胞檢測出了與陽性對照一致的相對分子質量分別為67000、68000、55500 的ALB、AFP、CYP3A4條帶。

1.3 免疫組織化學技術：免疫組織化學是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定細胞內抗原的成分（主要是多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及定量的研究。Zhang等[7]在人胎肝前體細胞誘導的肝樣細胞中檢測到ALB、AFP、AAT的表達，確定待檢測細胞可表達肝細胞特異性基因。

1.4 ELISA：ELISA是酶聯免疫吸附試驗法的簡稱，其基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。通過洗滌將抗原抗體復合物與液相中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，通過反應結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，根據呈色的深淺進行定性或定量分析。Wang等[8]成功應用人ELISA定量裝置在人造血干細胞誘導的細胞中檢測出白蛋白的分泌，證實了人造血干細胞可誘導為有功能的肝樣細胞。

1.5 流式細胞術：流式細胞術是用流式細胞儀測量液相中懸浮細胞或微粒的一種現代分析技術。如今，流式細胞術與單克隆抗體結合，可對細胞內抗原進行定性、定量檢測[9]。用合適的固定劑及打孔劑對細胞固定打孔。利用抗原抗體特異性反應，將熒光染料（熒光探針）連接于不同的單克隆抗體，當細胞被激光器發射的激光照射后，胞質的抗原抗體復合物上的熒光探針可以發射出不同光譜的繼發熒光，這些熒光通過流式細胞儀的識別和分辨，從而實現對細胞內抗原的定性、定量檢測。Arefeh等[10]用流式細胞術檢測到多功能干細胞誘導后細胞內白蛋白的合成，且表達白蛋白的細胞量已大于總細胞數的50%。

1.6 PAS染色檢測糖原合成：PAS染色又稱過碘酸雪夫氏染色，一般用來顯示糖原和其他多糖物質。其原理是過碘酸的氧化作用使糖類及有關物質中的1、2-乙二醇基為二醛，醛與Schiff試劑（無色亞硫酸品紅復合物）結合，形成紫紅色反應產物而得到定位。Huang等[11]應用PAS染法對干細胞誘導后細胞內糖原進行檢測，并證實了誘導成功的肝樣細胞具有合成糖原的功能。

1.7 肝細胞極性分布的檢測：細胞極化指細胞依據其生物功能的需要而產生的方向性和不對稱性，具有極化特性的細胞膜分別面對不同的細胞外環境，并發揮不同的生物學功能。肝細胞是體內具有典型極化特征的細胞。肝細胞膜分為3個區域：面向肝血竇的基底側膜、面向毛細膽管的頂膜、連接相鄰肝細胞的側膜。研究表明，極化肝細胞3個膜區中的蛋白質和脂質組成各不相同，基底側膜的標志性蛋白包括Na依賴牛磺膽酸共轉運多肽（NTCP）、低密度脂蛋白受體（LDLR）、多藥耐藥蛋白1，3，4，6（MDR1，3，4，6）、肝細胞生長因子受體（HGF-R）等；毛細膽管頂膜區包括多藥耐受蛋白1，3（MDR1，3）、多耐藥相關蛋白2（MRP2）和膽鹽輸出泵（BSEP）等；側膜區有構成緊密連接的標志性蛋白ZO-1等和構成間隙連接的結構蛋白連接素等[12]。趙磊等[13]證實了干細胞誘導后的肝樣細胞表達基底側膜極化蛋白NTCP、SR-B1和MRP2，表明誘導成功的細胞已具有肝細胞極性。

1.8 尿素的檢測：在氨基酸代謝過程中，有毒的氨在肝臟中經過鳥氨酸循環轉變成無毒的尿素排出體外。尿素合成是成熟肝細胞清除血氨的主要途徑。經干細胞誘導的細胞若具有合成尿素的功能，則證明誘導的肝樣細胞已具有肝細胞的代謝功能。Zhang等[7]成功地運用生化分析儀在人胚胎肝祖細胞誘導分化的細胞中檢測到尿素的生成，表明誘導后的肝樣細胞已具備代謝氨的功能。Bao等[14]在進行無血清及間充質干細胞與大鼠肝細胞球混合培養的實驗時，在培養基中加入重氨（15ND3），培養一段時間后，采用氣相色譜分析/質譜分析法檢測到富含氘（D）的重尿素的生成，同時采用尿素測試盒確定氨的清除隨著尿素的生成的增多而減少，該檢測不僅證實了體內氨的清除與尿素生成的關系密切，同時明確了同位素的應用更方便尿素的檢測。在我們尚未發表的研究中也使用這一方法對誘導的肝樣細胞尿素的來源進行檢測。

1.9 構建肝細胞特異性表達載體：啟動子作為基因調控序列的重要組成，在DNA轉錄成RNA的過程中，與轉錄調控因子相結合，與眾調控序列及因子一起作用，實現真核生物基因組織特異性表達。目前研究表明，肝細胞中的ALB、AAT、細胞色素P450等基因所含有的肝臟特異性轉錄調控序列如啟動子、增強子，可與肝臟富含的轉錄因子如HNF1、C/EBP及eH-TF等特異性結合，刺激基因僅在肝組織中高效轉錄[15]。將肝細胞特異性基因的啟動子連接于報告基因的上游，構建病毒（如腺病毒、慢病毒等）或非病毒（如質粒）載體，轉染干細胞，當干細胞向肝細胞分化時，啟動子與轉錄因子結合，啟動子被激活，調控報告基因的表達，報告基因的活性就間接反應了肝細胞特異性基因的表達水平，作為研究肝細胞成熟分化的一個檢測手段。張維玉等[16]成功構建pBGLuc-ALB質粒，并分別將質粒轉入肝系細胞與非肝系細胞中，同時檢測培養上清中分泌的熒光素酶活性。結果顯示熒光素酶活性：肝系細胞 >非肝系細胞，免疫熒光檢測ALB含量與熒光素酶活性一致。該研究組進一步應用逆轉錄病毒成功構建穩定表達ALB-GLuc的肝干細胞株，誘導肝干細胞向肝樣細胞分化，隨著誘導時間的延長，細胞培養上清中熒光素酶表達逐漸增高，免疫熒光結果也顯示ALB的表達越來越強，與熒光素酶活性增高的趨勢一致。

2 總結與展望

對于肝樣細胞的檢測技術不必要逐個試驗，可選用安全有效的技術對肝樣細胞代謝、合成功能等方面進行檢測，證實經干細胞成功誘導的肝樣細胞具有肝細胞的特性，使得干細胞治療安全、有效的應用于科研及臨床。

我國是肝病大國，乙型肝炎尤其嚴重。此外，隨著經濟的發展、生活水平的提高以及環境污染的加劇，由酒精性、藥物性以及免疫性因素等引發的肝病也在逐年增加。終末期肝病是各類肝病的晚期表現。肝移植是目前治療終末期肝病的有效方法，但由于供體受限，限制了其發展。多年來，國內外學者致力于肝移植替代治療的研究。自1999年Petersen等[17]發現骨髓中有干細胞具有向肝細胞分化的潛能以來，人們開始研究應用干細胞治療肝臟疾病的可行性，后來發現不同來源的干細胞如骨髓間充質干細胞、臍血干細胞、脂肪干細胞等均可定向誘導分化為肝樣細胞，具有正常肝細胞生物學功能，如合成糖

原、分泌尿素、白蛋白等，且得到動物實驗的驗證，臨床亦有自體回輸骨髓干細胞治療肝病的報道。隨著研究的增加，干細胞治療為終末期肝病的治療提供了一個新的方向。

應用細胞移植治療肝臟疾病需要大量的、功能良好的肝樣細胞，因此提供一條切實可行，經濟方便的檢測方法尤為重要。目前的檢測方法，主要從合成白蛋白、糖原，分泌尿素及細胞色素P450功能等方面對誘導分化的肝樣細胞進行檢測。這些檢測多在誘導分化過程結束后進行，并未對整個誘導分化過程進行監測。在肝細胞某些功能如儲存脂溶性維生素A、D、E和K，葉酸，維生素B12，微量元素銅、鐵等方面仍缺乏檢測技術。體外誘導分化的肝樣細胞要求能與在體的肝細胞生物學功能保持一致，才可能在接近生理的情況下用于研究干細胞移植、 生物人工肝供體等[18]。因此研究出特異性強、靈敏度高、對細胞或機體影響小、方法簡單易行的檢測技術是保證干細胞治療有效、安全地用于基礎及臨床研究的重中之重。

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文章編號：1671-8194（2016）07-0036-03

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