枯草芽孢桿菌8-32拮抗菌株的紫外誘變選育

高同國，賈天瑤，郭曉軍，張冬冬，朱寶成

(河北農業大學 生命科學學院，河北 保定　071001)

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枯草芽孢桿菌8-32拮抗菌株的紫外誘變選育

高同國，賈天瑤，郭曉軍，張冬冬，朱寶成

(河北農業大學 生命科學學院，河北 保定071001)

摘要：為了獲得更高拮抗活性的菌株，以對大豆根腐病病原菌具有較強拮抗作用的Bacillus subtilis 8-32為實驗材料，采用紫外線誘變方法選育具有更高拮抗活性菌株.紫外誘變條件為30 W紫外線，15 cm輻射距離，誘變時間4 min.結果表明，經初篩和復篩，從誘變后菌落形態差異顯著的100個菌株中，篩選得到3株(YB-1，YB-2和YB-3)拮抗活性明顯增強的菌株，其拮抗活性與對照相比分別提高了50%，55%和50%，并且傳代培養10次后其活性保持不變，說明誘變菌株YB-1，YB-2和YB-3遺傳性狀穩定.

關鍵詞：大豆根腐病；枯草芽孢桿菌；尖孢鐮刀菌；紫外誘變

第一作者：高同國(1984-)，男，河北邢臺人，河北農業大學講師，博士，主要從事植物真菌病害及生物防治研究.

E-mail：gtgrxf@163.com

大豆是世界上重要的糧食及經濟作物，近些年由于重茬、迎茬比例不斷增加，大豆根腐病日趨嚴重，成為制約大豆生產的主要病害之一.僅黑龍江墾區大豆根腐病發病率就為75%~90%，感病品種產量損失為5%~10%，嚴重可達90%以上，有的甚至絕產[1]，給我國經濟帶來嚴重損失.

大豆根腐病(soybean root rot)是大豆根部和莖部疾病的統稱[2]，是一種根治困難、危害嚴重的常發性土傳病害.大豆根腐病在整個生長期都有可能發生，病原菌通過浸染植株的根、莖、葉以及部分豆莢，引起根和莖的腐爛、植株矮化、枯萎,最終導致大豆死亡.大豆根腐病的致病菌有多種，其中以尖孢鐮刀菌為主要致病菌[3].目前，對大豆根腐病的治療主要依靠化學農藥，但化學農藥的使用造成嚴重的環境污染，所以生物防治土傳染疾病逐漸引起大家的關注[4],并且由于細菌自身的優點，在生物防治中展現出良好的發展前景，因此，用生物來防治疾病的研究與開發有著重要的意義[5-7].

目前用于生物防治的菌株中研究最多的是芽孢桿菌屬(Bacillussp.)和假單胞菌屬(pseudomonassp.)，芽孢桿菌可以產生內生芽孢，抗逆能力強，繁殖速度快，營養要求簡單，易定殖在植物表面，其逐漸成為世界上生防細菌研究的重點.如Zhang等[8]采用拌種和根施2種方法研究了10株枯草芽孢桿菌在防治鐮刀菌引起的根腐病上的效果，其中4株細菌對根腐病的防治效果達到43%~63%.芽孢桿菌BH1對尖孢鐮刀菌引起的大豆根腐病的田間防效達56.1%，大豆增產7.6%[9-10]；細菌 BRF-1可促進大豆幼苗生長，在豆長連、重1年和正茬土壤上，對大豆根腐病的防治效果分別達 53.9%,34.4%和 15.8%[11].上述研究均表明芽孢桿菌可以有效地防治大豆根腐病的發生，目前可用于大豆根腐病的商業菌劑中的菌種以枯草芽孢桿菌為主，如Bio safe，Companion，HiStick N/T等[12]，但這些產品主要集中在美國等發達國家，國內對大豆根腐病的防治雖然取得了一定的進展，但是有效的商業化菌劑依然很少.

在前期工作中，以大豆根腐病病原菌——尖孢鐮刀菌為指示菌，從實驗室保存的237株細菌中篩選得到1株對尖孢鐮刀菌具有明顯拮抗作用的菌株Bacillussubtilis8-32，平板對峙實驗表明其抑菌圈直徑達21.62 mm，孢子萌發抑制率達42.5%~71.6%，溫室生防效果顯示該菌株使大豆根腐病病情指數降低了32.08%.為進一步提高其拮抗能力，本實驗擬通過對枯草芽孢桿菌(B.subtilis)8-32進行紫外誘變，篩選出具有更強拮抗性能的菌株，為8-32菌劑的開發及大豆根腐病的防治奠定基礎.

1材料與方法

1.1　材料

生防細菌：枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis8-32(本實驗室篩選保藏).

大豆根腐病病原真菌：尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)(由中國科學院東北地理與農業生態研究院王光華教授提供).

1.2　方法

1.2.1菌種活化

尖孢鐮刀菌的活化：取保存好的尖孢鐮刀菌斜面1支，挑取1塊菌落接種在PDA培養基平板上，倒置放在28 ℃的培養箱中培養，培養3~5 d.

枯草芽孢桿菌的活化：取實驗室保存好的枯草芽孢桿菌斜面1支，用劃線的方法接種在NA培養基平板上，倒置放在37 ℃的培養箱中培養，培養1~2 d.

1.2.2枯草芽孢桿菌8-32生長曲線的測定

用竹簽挑取活化好的枯草芽孢桿菌，接種到NB培養基中，37 ℃，180 r/min震蕩培養12 h.再按1%的接種量接種到新鮮的NB培養基中，37 ℃，180 r/min震蕩培養，并每隔2 h取樣，測定樣品在600 nm波長下的吸光度，并繪制生長曲線[13-14].

1.2.3紫外誘變方法

參考文獻紫外誘變方法根據[15]，具體步驟如下：將活化好的8-32菌種接種于NB培養基中，置于37 ℃，180 r/min的搖床上震蕩培養7 h.將培養好的菌液離心，4 000 r/min，15 min收集菌體，并用生理鹽水洗滌2次，調整細胞濃度為108~109/mL，待用.將制作好的菌懸液倒入平皿中(加液量為15 mL左右)，加入轉子，放置在磁力攪拌器上與紫外燈(30 W)相距15 cm處，分別照射0，1，2，4 min.在紅燈下對誘變后的菌懸液進行梯度稀釋，并選擇合適的梯度涂布平板，涂好后放入37 ℃黑暗培養箱中倒置培養24 h.對培養后的平板計數，并計算菌體的存活率.

1.2.4檢測平板的制備

將約20 mL滅菌PDA培養基倒入培養皿中，作為底層培養基.取5 mL無菌水倒入病原菌活化平板并用接種針刮取孢子制成菌懸液，將菌懸液倒入45 ℃左右的滅菌PDA培養基，混勻鋪板，作為上層培養基,待平板冷卻后制成含有病原菌的PDA檢測平板.

1.2.5枯草芽孢桿菌的誘變及篩選

根據致死率曲線選擇致死率為80%~90%的誘變時間對枯草芽孢桿菌進行誘變，步驟同1.2.3.挑取紫外誘變后形態特征不同的枯草芽孢桿菌單菌落，用十字劃線的方法接種在尖孢鐮刀菌鑒定平板上，進行初篩.將平板倒置放在28 ℃的培養箱中培養48~72 h，觀察并挑選出抑菌圈比較大的單菌落進行復篩.采用瓊脂擴散抑菌圈法對初篩后抑菌圈比較大的菌體進行復篩.首先對初篩后的菌體進行液體發酵培養24 h，然后將發酵液4 000 r/min離心20 min，取上清液加入所打的孔中，放在28 ℃的培養箱中培養48~72 h，觀察并測量抑菌圈的直徑，計算抑菌圈增長率.

1.2.6遺傳穩定性測定

將復篩后抑菌圈比較大的菌株(YB-1，YB-2，YB-3)進行傳代培養，用竹簽挑取經過復篩后抑菌圈比較明顯的單菌落，用劃線的方法接種在NA培養基平板上，培養24 h，重復10次，即完成傳代培養10代.對傳代培養10代以后的菌株發酵培養24 h，采用瓊脂擴散抑菌法觀察抑菌圈的變化情況，同時與出發菌株的抑菌圈進行比較，分析此菌株的穩定性.

2結果與分析

2.1　生長曲線的繪制

本實驗采用分光光度法對枯草芽孢桿菌8-32的生長曲線進行測定，結果見圖1.結果顯示：0~2 h菌體處于調整期，2~20 h菌體處于對數期，20~90 h菌體處于穩定期；90 h以后菌體死亡速率大于生長速率，菌體處于衰亡期.本實驗選取對數期的菌體進行研究，選擇生長7 h(對數生長初期)的菌體作為研究對象.

圖1　8-32的生長曲線

2.2　誘變后菌體存活率

根據生長曲線，對培養7 h的菌體進行紫外誘變，在30 W紫外燈，輻射距離15 cm條件下，以NA為培養基，采用梯度稀釋涂布平板方法，研究不同輻射時間對8-32菌體存活數量的影響，結果見圖2和圖3.由圖2可知，隨著紫外照射時間的延長菌體的存活率越來越低.通過對圖2平皿上的菌體計數，計算出不同誘變時間下菌體的存活數量，繪制存活率曲線.由圖3可知，當誘變時間為1 min時，其存活率為66.40%，2 min的存活率為26.60%，4 min的存活率為17.5%.

2.3　初篩結果

對誘變處理4 min，避光培養24 h后形態不同的菌體進行篩選.通過對100個形態不同的菌株進行篩選，得到3株抑菌效果較強的菌株，篩選結果如圖4.結果顯示：與對照菌相比較，YB-1,YB-2和YB-3的抑菌效果都有所增加，將這3株菌進行保藏并對其復篩，進一步研究其抑菌作用.

圖2　紫外誘變不同時間后8-32菌體存活數量

圖3　紫外誘變不同時間8-32菌體存活率變化曲線

圖4　誘變后初篩結果

2.4　復篩結果

采用瓊脂擴散抑菌圈法對初篩得到的3株抑菌活性較高的菌株(YB-1，YB-2，YB-3)進行復篩，結果見圖5.結果表明，誘變后得到的3株細菌YB-1,YB-2和YB-3的抑菌圈直徑與對照菌相比較都有明顯的增大.與對照菌相比較，YB-1，YB-2和YB-3抑菌圈的平均直徑分別增加了50%，55%和50%.

圖5　復篩結果

2.5　遺傳穩定性檢測

對復篩得到的3株抑菌活性較高的菌株進行連續傳代培養， YB-1，YB-2和YB-3連續傳10代后分別標記為YB-1-C，YB-2-C和YB-3-C.采用瓊脂擴散抑菌圈法對傳代后的菌株進行穩定檢測(圖6)，結果顯示經過傳代培養10代以后，抑菌圈大小未有明顯改變，說明本實驗篩選得到的3株菌株的高產性狀可以穩定遺傳.

圖6　誘變菌株遺傳穩定性檢測

3討論

大豆根腐病是引起大豆減產的主要原因之一，生物防治因其高效、安全、無污染等優點越來越引起人們的重視.采用紫外線進行誘變育種是生防菌株常用的育種方法之一，如王靜等[16]對枯草芽孢桿菌 B47進行了2次紫外誘變選育，誘變后其菌株對西瓜枯萎病病菌的拮抗能力提高37.5%~68.8%，賈潔等[17]采用紫外誘變后其菌株對大腸桿菌的抗菌活性提高58.49%.本研究通過紫外誘變選育方法也成功篩選出3株拮抗活性明顯提高的菌株，其活性與誘變前相比分別提高了50%，55%和50%，并且該3株細菌遺傳性狀穩定.但研究中未能對突變株的生防效果進行跟蹤實驗，也未能明確突變株產生的拮抗物質和抗菌譜是否發生了改變，上述問題還需要進一步深入研究.

綜上所述，本研究通過紫外誘變技術選育出3株具有更高拮抗能力的菌株YB-1，YB-2和YB-3，其拮抗活性分別提高50%，55%和50%，且3株細菌的遺傳穩定性良好.

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(責任編輯：趙藏賞)

Ultraviolet mutation of antagonistic strainBacillussubtilis8-32

GAO Tongguo, JIA Tianyao, GUO Xiaojun, ZHANG Dongdong, ZHU Baocheng

(College of Life Science, Agricultural University of Hebei, Baoding 071001, China)

Abstract:In order to obtain higher antagonistic activity producing strains, Bacillus subtilis 8-32 which had significant antagonistic against to soybean root rot was used to get more effective strains through ultraviolet mutagenesis method. Conditions for mutagenesis were 30 W UV lamp, 15 cm irradiation distance and irradiation dose of 4 min. Results showed that 100 different morphology colonies of bacteria were picked according to first and second screening, and three strains (YB-1, YB-2, YB-3) which had higher antagonist activities were screened from 100 mutation colonies, their activities were increased by 50%, 55% and 50%, respectively, and the activities were unchanged after 10 generations.

Key words:soybean root rot; Bacillus subtilis; Fusarium oxysporum; UV mutagenesis

基金項目：河北省自然科學基金資助項目(C2015204031);保定市科學技術研究與發展計劃項目(13ZN023)

收稿日期：2015-05-20

中圖分類號：Q933

文獻標志碼:A

文章編號：1000-1565(2015)06-0610-06

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.06.010