黑木耳富硒發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉建榮，溫秀榮，顧雅君

(1. 河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定　071002；2. 保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林與生物工程系，河北 保定　071051；

3. 河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定　071002)

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黑木耳富硒發(fā)酵條件的優(yōu)化

劉建榮1，溫秀榮2，顧雅君3

(1. 河北大學(xué) 生物技術(shù)研究中心，河北 保定071002；2. 保定職業(yè)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)林與生物工程系，河北 保定071051；

3. 河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定071002)

摘要：為獲得富硒黑木耳菌絲體，以亞硒酸鈉為硒源對黑木耳(Auricularia auricular)高產(chǎn)菌株G6進(jìn)行富硒發(fā)酵條件優(yōu)化．以菌絲體性狀和菌絲體硒含量為指標(biāo)考查不同硒質(zhì)量濃度對其生長的影響，并確定最適硒質(zhì)量濃度；通過單因素和正交實驗對G6菌株液體富硒發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化．結(jié)果，培養(yǎng)基中硒質(zhì)量濃度<50 mg/L 時，菌絲體的硒含量隨硒質(zhì)量濃度的提高而提高；硒質(zhì)量濃度為50 mg/L時，菌絲體硒含量最高，為8.5 μg/g；硒質(zhì)量濃度>50 mg/L 時，硒含量不升反降.表明適量亞硒酸鈉有利于菌絲體對硒的吸收和利用，過量添加時則抑制菌絲體生長，不利于菌絲體對硒的吸收和利用．優(yōu)化后的富硒黑木耳G6菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為硒質(zhì)量濃度50 mg/L，玉米粉15 mg/L ，豆餅粉20 mg/L，裝液量200 mL/500 mL三角瓶，轉(zhuǎn)速160 r/min，25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)6 d．發(fā)酵液中菌絲體硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到9.2 μg/g，發(fā)酵液多糖質(zhì)量濃度可達(dá)3.7 g/L．

關(guān)鍵詞：黑木耳；硒；多糖；發(fā)酵

Optimization of Se-enriched fermentation conditions

ofAuriculariaauricula

LIU Jianrong1，WEN Xiurong2，GU Yajun3

(1. Research Center of Biotechnology，Hebei University，Baoding 071002，China；2. Department of

Agriculture,Forestry and Bioengineering,Baoding Vocational College，Baoding 071051，China；

3. College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China)

第一作者：劉建榮(1963-)，女，河北保定人，河北大學(xué)副研究員，主要從事生化及微生物學(xué)研究．

黑木耳(Auriculariaauricula)是藥食兩用的優(yōu)質(zhì)大型食用真菌.黑木耳中的膠質(zhì)體具有較強(qiáng)的吸附能力，可把殘留在人體消化系統(tǒng)中的灰塵和雜質(zhì)聚集起來，起到清除胃腸異物的作用，因此是從事采礦、紡織和化工生產(chǎn)等行業(yè)人員良好的保健食品．真菌多糖自20世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性以來[1]，眾多學(xué)者開展了對黑木耳多糖的研究，并證實其具有抗凝血、降血脂、抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和抑制腫瘤等作用[2-3]．硒(Se)是人體正常生理活動所必需的一種微量元素，是體內(nèi)抗氧化酶——谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的重要組成部分．人體的貧血、慢性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肝硬化、大骨節(jié)病等多種疾病的發(fā)生，大多與人體內(nèi)缺乏硒元素相關(guān)，且硒的缺乏還會增加罹患前列腺癌、皮膚癌、肺癌和結(jié)腸癌的風(fēng)險[4-5]．然而硒常以無機(jī)鹽態(tài)存在于自然界，不僅不利于人體吸收，而且含量還相當(dāng)稀少和分散．目前世界各國都普遍存在著硒攝入不足的問題，嚴(yán)重威脅著人體健康．只依靠天然食品補(bǔ)硒很難從根本上改善人體缺硒狀態(tài)．研究發(fā)現(xiàn)，黑木耳菌絲體具有很強(qiáng)的富硒能力[6]．菌絲體可將無機(jī)態(tài)硒轉(zhuǎn)化為能被人體所吸收利用的有機(jī)態(tài)硒多糖和硒蛋白，并在細(xì)胞中富集．對腫瘤生長的抑制作用，黑木耳硒多糖優(yōu)于黑木耳多糖[7]．因此，將食用菌和有機(jī)硒食于一體的天然營養(yǎng)保健食品的研究和開發(fā)已成為研究熱點(diǎn),但是鮮有對黑木耳進(jìn)行液體富硒發(fā)酵的研究．本研究以亞硒酸鈉為硒源，通過單因素和正交實驗對篩選所得的黑木耳高產(chǎn)菌株進(jìn)行液體富硒發(fā)酵條件的優(yōu)化，以期獲得優(yōu)質(zhì)富硒黑木耳菌絲體，從而為后續(xù)研制和開發(fā)富硒黑木耳食藥制品提供實驗依據(jù)．

1材料與方法

1.1　材料與儀器

1.1.1黑木耳菌株

黑木耳高產(chǎn)菌株G6，為本實驗室自60個來自華北地區(qū)較優(yōu)良的黑木耳栽培菌株中經(jīng)篩選所得．

1.1.2CPDA培養(yǎng)基斜面

去皮馬鈴薯200 g，切碎，加適量水煮沸30 min，紗布過濾.于濾液中加入瓊脂20 g，加熱溶解后依次加葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀2 g和硫酸鎂0.5 g，補(bǔ)水至1 L.分裝試管，于121 ℃濕熱滅菌20 min，取出并擺斜面，冷卻后儲存?zhèn)溆茫?/p>

1.1.3液體富硒發(fā)酵培養(yǎng)基

每L培養(yǎng)基含有豆餅粉20 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀4 g，硫酸鎂2 g，亞硒酸鈉50 mg，VB 110 mg，自然pH．

1.1.4主要儀器

UV-1800 紫外可見分光光度計(天美有限公司)，熒光分光光度計 F96S(上海奧析科學(xué)儀器有限公司)，HWY-211B-旋轉(zhuǎn)式搖床(上海智誠分析儀器有限公司)．

1.2　方法

1.2.1硒質(zhì)量濃度對G6菌株生長的影響

在CPDA培養(yǎng)基中分別添加0，10，30，50，70，90 mg/L亞硒酸鈉，常規(guī)接種黑木耳菌株G6，考察不同硒質(zhì)量濃度下的各菌株菌絲形態(tài)和發(fā)菌時間，測定菌絲體中的硒含量，考察不同硒質(zhì)量濃度對G6生長的影響，并確定富硒最適硒質(zhì)量濃度．

1.2.2高產(chǎn)黑木耳G6菌株富硒發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.2.1生長時間對篩選確定的黑木耳高產(chǎn)菌株進(jìn)行液體富硒搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化．用接種鏟將已活化的斜面菌種分割為5 mm×5 mm的小菌塊，接種于液體富硒發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為200 mL/500 mL三角瓶，3組平行實驗，于旋轉(zhuǎn)式搖床(150 r/min)25 ℃下分別培養(yǎng)8 d，每天定時取樣，分析不同生長時間對發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響，以確定最優(yōu)生長時間．

1.2.2.2碳源同1.2.2.1分別接種小菌塊于4種不同碳源即蔗糖、葡萄糖、玉米粉、麥芽糖的富硒發(fā)酵培養(yǎng)基中(添加質(zhì)量濃度均為20 g/L)，裝液量均為200 mL/500 mL三角瓶，做3組平行實驗，以上述實驗確定的最優(yōu)生長時間于旋轉(zhuǎn)式搖床(150 r/min)25 ℃下培養(yǎng)，分析不同碳源對發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響，以確定最優(yōu)碳源．

1.2.2.3氮源分別接種小菌塊于4種不同氮源即豆餅粉、蛋白胨、酵母膏、尿素的上述優(yōu)化了碳源的富硒發(fā)酵培養(yǎng)基中(添加質(zhì)量濃度均為20 g/L)，裝液量200 mL/500 mL三角瓶，3組平行實驗，以上述實驗確定的最優(yōu)碳源和生長時間于旋轉(zhuǎn)式搖床(150 r/min)25 ℃下培養(yǎng)，分析不同氮源對發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響，以確定最優(yōu)氮源．

1.2.2.4轉(zhuǎn)速分別接種小菌塊于上述優(yōu)化培養(yǎng)基中，裝液量200 mL/500 mL三角瓶，3次平行實驗，分別在100 ，130 ，160 ，190 r/min轉(zhuǎn)速下，以上述實驗確定的最優(yōu)碳、氮源和生長時間于25 ℃進(jìn)行搖床培養(yǎng)，分析不同轉(zhuǎn)速對發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響，以確定最優(yōu)轉(zhuǎn)速．

1.2.2.5裝液量分別接種小菌塊于上述優(yōu)化培養(yǎng)基中，500 mL三角瓶中培養(yǎng)基的裝液量分別為100，150 ，200 ，250 mL，做3組平行實驗，按上述確定的最適條件于25 ℃進(jìn)行搖床培養(yǎng)，分析不同裝液量對發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響，以確定最優(yōu)裝液量．

1.2.2.6正交實驗為全面考察各因素及其相互作用對發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以碳源(A)、氮源(B)、轉(zhuǎn)速(C)、生長時間(D)、裝液量(E)為實驗因素，以發(fā)酵液菌絲體硒含量為考查指標(biāo)，設(shè)計了L1645正交實驗，各因素水平見表1．

表1　正交實驗因素水平(L1645)

1.2.3分析方法

苯酚-硫酸法測定發(fā)酵液多糖[8]；參照國家安全標(biāo)準(zhǔn)食品中硒的測定方法(熒光法)[8]測定自發(fā)酵液中獲得的干菌絲體硒含量；菌絲干重的測定：將培養(yǎng)6 d的發(fā)酵培養(yǎng)物取出20 mL抽濾得粗菌絲體，用蒸餾水沖洗3次后于60 ℃烘箱中烘干至恒重．

2結(jié)果與分析

2.1　硒質(zhì)量濃度對G6菌株生長的影響

不同質(zhì)量濃度的亞硒酸鈉對G6菌株生長的影響結(jié)果見表2．結(jié)果顯示，添加亞硒酸鈉菌株各項指標(biāo)均優(yōu)于未施加亞硒酸鈉的菌株．當(dāng)硒質(zhì)量濃度<50 mg/L時，各菌株菌絲濃密粗壯，長勢良好，發(fā)菌時間隨亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的提高而縮短，菌絲體硒含量隨亞硒酸鈉質(zhì)量濃度的提高而提高，在50 mg/L時達(dá)最高，是無添加硒G6的21倍；硒質(zhì)量濃度>50 mg/L時，菌絲生長纖弱，發(fā)菌時間不再減少，硒含量亦開始降低．結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加適量硒可促進(jìn)菌絲的生長和對硒的富集，過量反而抑制菌絲生長，降低富集硒的能力．

表2　硒質(zhì)量濃度對G6菌株菌絲生長和硒含量的影響

2.2　G6菌株富硒發(fā)酵條件的優(yōu)化

通過單因素和正交實驗對G6菌株液體富硒發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，分析不同因素對富硒發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響，以確定最優(yōu)富硒發(fā)酵條件．

2.2.1生長時間對G6富硒發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響

對G6培養(yǎng)不同時間的發(fā)酵液所測得多糖含量和菌絲體硒含量如圖1所示．由圖1可見，在1~6 d菌絲體硒含量和發(fā)酵液多糖含量逐漸升高，6~8 d基本平穩(wěn)，6 d時發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度為2.50 g/L，菌絲體硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.51 μg/g，之后略有下降．綜合經(jīng)濟(jì)節(jié)能考慮，選取培養(yǎng)時間為6 d．超過6 d，黑木耳的生長即進(jìn)入衰退期，致使多糖含量和硒含量開始降低．

2.2.2碳源對G6富硒發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響

采用4種不同碳源的培養(yǎng)基對富硒黑木耳G6菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，測定發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量，結(jié)果見圖2．由圖2可見，以玉米粉為碳源的培養(yǎng)基的發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度最高，可達(dá)2.91 g/L，菌絲體硒含量以葡萄糖和玉米粉為碳源時最高．表明葡萄糖和玉米粉較其他碳源更適宜黑木耳生長．從成本考慮，確定玉米粉作為富硒黑木耳G6菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最適碳源．

圖1　生長時間對G6富硒發(fā)酵液多糖

圖2　碳源對G6富硒發(fā)酵液多糖

2.2.3氮源對G6富硒發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響

采用4種不同氮源的培養(yǎng)基對富硒黑木耳G6菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，測定發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量，結(jié)果如圖3所示．由圖3可見，以豆餅粉為氮源的培養(yǎng)基發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度和菌絲體硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為2.64 g/L和8.60 μg/g．表明豆餅粉為富硒黑木耳G6菌株液體發(fā)酵的最優(yōu)氮源，故選取豆餅粉為培養(yǎng)基的最佳氮源．

2.2.4轉(zhuǎn)速對G6富硒發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響

4種不同轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)所得發(fā)酵液中的多糖含量和菌絲體硒含量如圖4所示．由圖4可見，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min時，發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度和菌絲體硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為3.64 g/L和8.92 μg/g,所以，確定搖床轉(zhuǎn)速160 r/min為富硒黑木耳G6菌株液體發(fā)酵時的最優(yōu)轉(zhuǎn)速．

圖3　氮源對G6富硒發(fā)酵液多糖

圖4　轉(zhuǎn)速對G6富硒發(fā)酵液多糖

2.2.5裝液量對G6菌株發(fā)酵液菌絲體硒含量和多糖含量的影響

4種不同裝液量的三角瓶于搖床發(fā)酵后所得發(fā)酵液中多糖含量和菌絲體硒含量如圖5所示．由圖5可見，當(dāng)裝液量為200 mL/500 mL三角瓶時，搖床發(fā)酵后所得發(fā)酵液中多糖質(zhì)量濃度和菌絲體硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別為3.64 g/L和9.02 μg/g．因此，搖瓶裝液量選取200 mL/500 mL三角瓶．裝液量的多或少，即耗氧量過高或過低，都會影響菌絲體的正常生長．

圖5　裝液量對G6富硒發(fā)酵液多糖含量和菌絲體硒含量的影響

2.2.6正交實驗

以發(fā)酵液中菌絲體的硒含量為指標(biāo)，通過正交實驗考察了5個因素對菌絲體硒含量的影響，結(jié)果見表3．根據(jù)極差分析R值可知，5因素對菌絲體硒含量的影響順序為A>D>B>C>E，即碳源>生長時間>氮源>轉(zhuǎn)速>裝液量，最優(yōu)組合為A3B4C3D3E3，即優(yōu)化后的富硒黑木耳G6菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)條件為硒質(zhì)量濃度50 mg/L,玉米粉15 mg/L ，豆餅粉20 mg/L，裝液量200 mL/500 mL三角瓶，轉(zhuǎn)速160 r/min，25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)6 d，此時干菌絲體中硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高可達(dá)8.7 μg/g．

表3　正交實驗結(jié)果及分析

K.均值；R.極差.

以上述正交實驗確定的最優(yōu)組合在25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)6 d進(jìn)行驗證實驗，驗證結(jié)果，該組合菌絲體硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到9.2μg/g發(fā)酵液多糖質(zhì)量濃度可達(dá)3.7g/L．

3討論

食用菌具有富硒能力，黑木耳也不例外，已被許多研究者的實驗所證實[8-10]．高產(chǎn)黑木耳G6菌株也具有富集硒的能力，但亞硒酸鈉在培養(yǎng)基中的質(zhì)量濃度對黑木耳菌絲體的生長及富硒效果會產(chǎn)生很大影響．相比較于不添加亞硒酸鈉，適量的亞硒酸鈉對黑木耳菌絲體的生長及菌絲體對硒的富集均有促進(jìn)作用；但過量添加，反而會抑制菌絲體的生長[11]．

培養(yǎng)基可提供微生物生長繁殖和代謝以及合成產(chǎn)物所需要的各種營養(yǎng)物質(zhì)，其組成和配比對菌體的生長發(fā)育、提取工藝及產(chǎn)物成品的產(chǎn)量和質(zhì)量都有相當(dāng)程度的影響．在營養(yǎng)成分良好、配比適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基和合適的發(fā)酵條件下，菌株能充分發(fā)揮其合成產(chǎn)物的能力，可得到良好的生產(chǎn)效果．如果培養(yǎng)基的成分配比或發(fā)酵條件不合適，則會影響目的產(chǎn)品的收率和產(chǎn)品的質(zhì)量．為此，通過單因素和正交實驗對富硒黑木耳G6菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最適富硒發(fā)酵條件為硒質(zhì)量濃度50 mg/L，玉米粉15 mg/L，豆餅粉20 mg/L等，裝液量200 mL/500 mL三角瓶，轉(zhuǎn)速160 r/min，25 ℃發(fā)酵培養(yǎng)6 d．在此培養(yǎng)條件下，黑木耳富硒G6高產(chǎn)菌株的生長最佳，轉(zhuǎn)化率最高，有機(jī)物質(zhì)積累最多，發(fā)酵液中菌絲體硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到9.2 μg/g，發(fā)酵液多糖質(zhì)量濃度可達(dá)3.7 g/L．

對篩選獲得的黑木耳G6菌株富硒搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化，獲得了優(yōu)質(zhì)富硒黑木耳菌絲體，為后續(xù)放大規(guī)模生產(chǎn)菌絲體用于開發(fā)富硒黑木耳食藥制品的研制提供了實驗依據(jù)．

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(責(zé)任編輯：趙藏賞)

E-mail：bioinfo5@hbu.edu.cn

E-mail：yajun4502@163.com

Abstract:To obtain Se-enriched Auricularia auricular mycelium, the Se-enriched fermentation conditions of strain G6 of high yield A. auricular was optimized. While the traits and selenium content of mycelium were taken as indicators, the influence of selenium concentration on growing of strain G6 was carried out by adding different concentration of sodium selenite (Na2SeO3) as selenium source in CPDA medium in order to determine the optimum selenium concentration. The Se-enriched liquid fermentation conditions of strain G6 were optimized by single factor and orthogonal test. Experimental results showed that selenium content of mycelium increased with the increase of selenium concentrations when the Na2SeO3concentrations were less than 50 mg/L, and reached the highest value of 8.5 μg/g at 50 mg/L of Na2SeO3concentration, but reduced with the increase of selenium concentration when over 50 mg/L of Na2SeO3concentration. This indicated that the appropriate amount of Na2SeO3helped mycelium absorb selenium, but too much of it would restrain mycelium from growing and was bad for the mycelium to absorbent selenium. Optimized fermentation conditions of strain G6 were the Na2SeO3concentration of 50 mg/L, corn flour 15 mg/L, soybean cake powder 20 mg/L, liquid capacity of 200 mL/500 mL triangle bottle, at the rotate speed of 160 r/min and culture time for 6 d at 25 ℃. Under the fermentation condition, the selenium content of G6 mycelium and the polysaccharide content of fermenting liquid reached to 9.2 μg/g and 3.7 g/L respectively.

Key words:Auricularia auricula; selenium; polysaccharide; fermentation

通信作者：顧雅君(1962-)，女，河北保定人，河北大學(xué)副研究員，主要從事真菌及微生物酶學(xué)研究．

基金項目：河北省科技支撐計劃項目(12227107D-1)

收稿日期：2015-06-25

中圖分類號：Q939.96

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號：1000-1565(2015)06-0616-07

DOI：10.3969/j.issn.1000-1565.2015.06.011