EAE小鼠胸腺萎縮與疾病嚴重程度關系的初步探究①

魏高輝　鄭配國　張俊華　馬雪涵　孟憲春　明　亮　劉紅春

(鄭州大學第一附屬醫院檢驗科，河南省檢驗醫學重點實驗室，鄭州450052)

[摘　要]　目的：研究EAE小鼠胸腺萎縮與疾病嚴重程度的關系。方法：MOG35-55肽免疫C57BL/6小鼠誘導EAE,分析EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮的關系，流式細胞分析胸腺CD4+CD8+雙陽性細胞、CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞與疾病嚴重程度的關系。 結果：尾部無力小鼠胸腺淋巴細胞數為(20.25±3.49)×106個，雙后肢無力小鼠胸腺淋巴細胞數為(4.93±0.85)×106個，雙后肢癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數為(1.8±0.19)×106個，四肢完全癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數為(0.52±0.07)×106個，組間差異有統計學意義(P<0.05)；EAE疾病越重，CD4+CD8+雙陽性細胞在胸腺細胞中的比例越低，CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例越高，不同疾病組間差異有統計學意義(P<0.05)。結論：EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮程度關系密切，EAE小鼠中活化T細胞的定向遷移可能導致胸腺萎縮。

[關鍵詞]　實驗性自身免疫性腦脊髓炎；胸腺；萎縮

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.003

EAE小鼠胸腺萎縮與疾病嚴重程度關系的初步探究①

魏高輝鄭配國張俊華馬雪涵孟憲春明亮②劉紅春②

(鄭州大學第一附屬醫院檢驗科，河南省檢驗醫學重點實驗室，鄭州450052)

[摘要]目的：研究EAE小鼠胸腺萎縮與疾病嚴重程度的關系。方法：MOG35-55肽免疫C57BL/6小鼠誘導EAE,分析EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮的關系，流式細胞分析胸腺CD4+CD8+雙陽性細胞、CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞與疾病嚴重程度的關系。 結果：尾部無力小鼠胸腺淋巴細胞數為(20.25±3.49)×106個，雙后肢無力小鼠胸腺淋巴細胞數為(4.93±0.85)×106個，雙后肢癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數為(1.8±0.19)×106個，四肢完全癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數為(0.52±0.07)×106個，組間差異有統計學意義(P<0.05)；EAE疾病越重，CD4+CD8+雙陽性細胞在胸腺細胞中的比例越低，CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例越高，不同疾病組間差異有統計學意義(P<0.05)。結論：EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮程度關系密切，EAE小鼠中活化T細胞的定向遷移可能導致胸腺萎縮。

[關鍵詞]實驗性自身免疫性腦脊髓炎；胸腺；萎縮

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.003

中圖分類號①本文為國家自然科學基金項目(81172835)。

通訊作者②，E-mail:xingyunerliu@163.com；E-mail:jykmingliang@163.com。

作者簡介：魏高輝(1989年-)，男，主要從事自身免疫病機制方面的研究，E-mail:wghyxjy@163.com。

[Abstract]Objective:To study the relationship between atrophy of the thymus and disease severity in EAE.Methods: MOG35-55 peptide induced EAE in C57BL/6 mice and analyzed the relationship between the severity of EAE and thymic atrophy，Flow cytometry analysis was used to evaluate thymic CD4+CD8+DP cells,CD4+CD8-,CD4-CD8+SP cells in relation to the severity of the disease.Results: The number of thymocytes in mice with decreased tail tone was (20.25 ± 3.49)×106,hindlimb weakness(4.93 ± 0.85)×106,complete hindlimb paralysis(1.8 ± 0.19)×106,and forelimb and hindlimb paralysis(0.52 ± 0.07)×106，there were statistically significant differences between groups(P<0.05).As the disease progresses,CD4+CD8+DP cells ratio decreased,CD4+CD8-,CD4-CD8+SP cell ratio increased,different disease groups was statistically significant difference (P<0.05).Conclusion: The atrophy of thymus was closely related to the severity of EAE.Migration of activated T cells in EAE may cause atrophy of thymus.

Preliminary inquiry EAE mouse atrophy of thymus relationship with disease severity

WEIGao-Hui,ZHENGPei-Guo,ZHANGJun-Hua,MAXue-Han,MENGXian-Chun,MINGLiang,LIUHong-Chun.ClinicalLaboratory,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,HenanKeyLaboratoryofMedicalLaboratory,Zhengzhou450052,China

[Key words]Experimental autoimmune encephalomyelitis;Thymus;Atrophy

多發性硬化(Multiple sclerosis,MS)是自身免疫相關的中樞神經系統脫髓鞘疾病，自身髓鞘抗原特異性CD4+T細胞與疾病密切相關[1]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是研究MS的理想動物模型，與MS具有類似的病理特征。Tsunoda等[2]研究發現，EAE小鼠可出現胸腺、脾臟、淋巴結的嚴重萎縮及大量胸腺淋巴細胞凋亡。胸腺作為中樞免疫器官，是T細胞分化發育的主要場所。前期研究發現，EAE小鼠發病高峰期胸腺嚴重萎縮，CD4+CD8+DP細胞減少。為探究EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮的關系，本研究計數不同疾病嚴重程度EAE小鼠胸腺淋巴細胞，分析T細胞亞群比例變化，探討胸腺淋巴細胞變化與疾病的關系，以期闡明胸腺萎縮機制。

1材料與方法

1.1材料C57BL/6小鼠6~8周齡在河南省實驗動物中心SPF級環境中飼養。髓鞘少突膠質細胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein,MOG35-55)由上海吉爾生化公司提供；百日咳毒素 (Pertussis toxin,PT ) 由北京聯立信生物技術有限責任公司提供；大鼠抗小鼠抗體(CD4-FITC,CD8-PE)由eBioscience公司提供。

1.2免疫小鼠實驗C57BL/6小鼠49只，隨機抽取45只小鼠誘導EAE，另外4只作為對照。誘導EAE：CFA(含5 mg/ml的滅活的結核桿菌素)與1.5 mg/ml的MOG溶液等體積混合后徹底乳化，于小鼠雙側背部皮下免疫(200 μl/只)，在免疫后當時和第二天尾靜脈注射PT稀釋液(200 μl/只)。對照組小鼠在雙側背部皮下注射PBS(200 μl/只)，在當天和第二天尾靜脈注射PBS(200 μl/只)。小鼠每天進行臨床評分：0分無臨床癥狀；0.5分尾部無力 ； 1.0分尾部癱瘓 ；1.5分一后肢無力 ； 2.0分兩后肢均無力 ；2.5分一后肢癱瘓另一后肢無力 ；3.0分雙后肢癱瘓 ；3.5分后肢癱瘓及前肢無力 ； 4.0分四肢全部癱瘓 ；5.0分死亡 。

1.3小鼠處理我們誘導的EAE小鼠發病特點是進展期進展迅速。小鼠處死時間以小鼠發病階段處于發病高峰期為準，我們確定EAE小鼠發病高峰期以臨床評分穩定不變3 d，在第3天處死小鼠，即發病高峰期小鼠。由于小鼠個體差異，發病時間及進展至高峰期時間不同，處死小鼠的時間依據上面的標準。EAE小鼠發病高峰期疾病嚴重程度各有不同，分組依據以發病高峰期小鼠臨床評分為準，在后期統計中對所有EAE小鼠進行分析。另外，為驗證緩解期變化，有一部分發病較重小鼠(臨床評分3.5以上)，分成EAE高峰期小鼠組和EAE緩解期小鼠組，EAE高峰期小鼠組在高峰期處死，EAE緩解期小鼠組繼續記錄觀察小鼠臨床評分，在EAE小鼠進入緩解期臨床評分穩定不變第3天處死，取胸腺。

1.4制備脊髓組織切片EAE小鼠在發病高峰期，在深度麻醉下，用40 g/L的多聚甲醛溶液進行心臟灌注，然后取出脊髓，放入40 g/L的多聚甲醛溶液中固定，切片進行HE染色觀察淋巴細胞浸潤和脫髓鞘現象。

1.5胸腺淋巴細胞分離計數及流式細胞術分析實驗組小鼠誘導EAE后，發病高峰期(依據見材料與方法1.3)記錄小鼠臨床評分；EAE緩解期小鼠組，在緩解期記錄小鼠臨床評分，頸部脫臼處死小鼠取小鼠胸腺，制成單細胞懸液，用牛鮑計數板計數細胞總數；然后計數1×106個細胞，進行熒光抗體染色，標記CD4-FITC、CD8-PE，30 min，4℃避光孵育，進行流式檢測(BD FACS Calibur)。

2結果

2.1EAE小鼠模型誘導成功C57BL/6小鼠雙側背部皮下MOG35-55肽乳化劑免疫，尾靜脈注射PT后，EAE小鼠病程經歷進展期，到達發病高峰期，出現典型的運動系統障礙的癥狀，EAE小鼠發病高峰期脊髓組織切片HE染色顯示大量炎性細胞浸潤(圖1A、B)；以上表明EAE小鼠模型誘導成功。對所有的實驗小鼠進行統計發現EAE誘導發病率達100%，在后期統計中對所有EAE小鼠進行分析，EAE發病高峰期小鼠疾病臨床評分分布：0.5分的2只，1.0分的6只，1.5分的2只，2.0分的11只，2.5分的2只，3.0分的14只，3.5分的3只，4.0分的5只，5.0分的無。

2.2EAE小鼠胸腺淋巴細胞數與疾病嚴重程度的關系計數EAE小鼠發病高峰期胸腺淋巴細胞，尾部無力小鼠胸腺淋巴細胞數為(20.25±3.49)×106個，雙后肢無力小鼠胸腺淋巴細胞數為(4.93±0.85)×106個，雙后肢癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數為(1.8±0.19)×106個，四肢完全癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數為(0.52±0.07)×106個，EAE小鼠胸腺淋巴細胞數與疾病嚴重程度關系密切。隨著EAE小鼠疾病嚴重程度的增加，胸腺淋巴細胞數量減少，組間差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

2.3胸腺淋巴細胞亞群與疾病嚴重程度的關系以EAE小鼠臨床評分分析胸腺淋巴細胞亞群的比例變化。其中臨床評分1.0分的小鼠6只，2.0分的小鼠11只，3.0分的14只，4.0分的2只；流式細胞分析發現，EAE小鼠臨床評分越高，胸腺CD4+CD8+雙陽性細胞比例越低，同時CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例增高(圖3A)。胸腺中CD4+CD8+雙陽性細胞與CD4+CD8-和CD4-CD8+單陽性細胞與EAE小鼠疾病嚴重程度關系密切，EAE疾病越重，CD4+CD8+雙陽性細胞比例越低，CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例越高(圖3B)，組間差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2　EAE小鼠不同臨床評分胸腺淋巴細胞數比較Fig.2　Comparing different clinical scoring number of thymocytes in EAE mice

圖3　EAE小鼠不同臨床評分及對照組小鼠胸腺細胞流式分析Fig.3　EAE group in different clinical score and control group result of flow cytometry of thymocyte

2.4EAE小鼠胸腺具有可復性研究EAE小鼠病程周期中胸腺細胞的變化規律，對發病高峰期EAE小鼠評分為4.0分的小鼠進行分組：EAE高峰期小鼠組2只和EAE緩解期小鼠組3只；EAE高峰期小鼠組小鼠處死，EAE緩解期小鼠組小鼠繼續觀察，發現3只全部進入緩解期，其中1只緩解期評分為2.0分，另外2只評分為1.0；選擇緩解期評分為1.0的小鼠與EAE高峰期小鼠組胸腺淋巴細胞計數進行比較，小鼠在發病高峰期胸腺淋巴細胞數顯著低于緩解期(P<0.01)(圖4)；流式細胞分析發現，進入緩解期的EAE小鼠胸腺淋巴細胞中CD4+CD8+雙陽性細胞比例回升，CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例降低，組間差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4　EAE小鼠發病高峰期和緩解期胸腺淋巴細胞數變化Fig.4　Change of peak and remission EAE mice thymocyte numberNote:*.P<0.01,one-way ANOVA.

3討論

EAE是一種廣泛使用的作為自身免疫病MS的動物模型[3]。EAE小鼠的中樞神經系統炎性脫髓鞘組織病理特點與MS相似。EAE發病高峰期，胸腺萎縮[2]。作為中樞免疫器官，胸腺維持機體免疫功能正常及免疫細胞發育成熟。胸腺易萎縮，Hirokawa等[4]發現胸腺萎縮與年齡關系密切，C57BL/6小鼠在成年后，隨年齡增長，胸腺重量減輕，體積減小，淋巴細胞減少。營養不良、應激、創傷都可導致胸腺萎縮[5]。而T淋巴細胞主要在胸腺中發育成熟，從來自骨髓的多能干細胞開始，經歷DN、DP、SP階段，通過陽性選擇和陰性選擇，無能T淋巴細胞和自身反應性T淋巴細胞以凋亡的形式被清除，有5%左右的T淋巴細胞發育成熟，釋放到外周發揮免疫功能,這些成熟的T細胞具備免疫反應性和自身免疫耐受的特點。

前期研究發現，EAE小鼠胸腺萎縮，細胞凋亡，其中主要凋亡細胞群是CD4+CD8+雙陽性細胞。在EAE中胸腺萎縮細胞凋亡，其與疾病嚴重程度的關系研究未見報道。我們利用發病高峰期疾病嚴重程度不同的EAE小鼠，探究胸腺萎縮情況，根據疾病嚴重程度，分析胸腺中不同淋巴細胞亞群的比例，以期掌握胸腺萎縮與疾病嚴重程度的關系，為進一步研究EAE發病機制及自身免疫病胸腺萎縮機制提供參考。

我們的實驗結果顯示，EAE小鼠中尾部無力小鼠胸腺淋巴細胞數為(20.25±3.49)×106個，雙后肢無力小鼠胸腺淋巴細胞數為(4.93±0.85)×106個，雙后肢癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數為(1.8±0.19)×106個，四肢完全癱瘓小鼠胸腺淋巴細胞數為(0.52±0.07)×106個，EAE疾病越重，胸腺淋巴細胞數量越少。胸腺萎縮與疾病嚴重程度關系密切；流式分析顯示隨疾病嚴重程度的增加，CD4+CD8+雙陽性細胞比例逐漸降低，CD4+CD8-、CD4-CD8+單陽性細胞比例逐漸升高，胸腺淋巴細胞亞群比例與疾病嚴重程度關系密切。Savino等[6]研究發現急性感染可導致胸腺萎縮，在急性感染免疫中，大量免疫細胞激活，遷移至炎癥部位，導致胸腺萎縮。在EAE發病高峰期，大量免疫細胞活化，據此推測可能導致胸腺萎縮的機制與急性感染相似。Yoh等[7]發現活化的T細胞遷移到中樞神經系統是導致EAE發病的主要原因，Martinez等[8]認為在中樞神經系統中Th1通過轉錄因子T-bet,分泌炎性細胞因子如IFN-γ，參與EAE的發病。又有學者發現Th17表達RORγt,分泌炎性細胞因子IL-17、IL-21、IL-22和TNF-α,在MS和EAE的發病過程中起關鍵作用[9]。上述學者的研究證實大量免疫細胞在中樞神經系統的聚集、活化及細胞因子的分泌，導致EAE的發生。EAE活躍階段，外周接觸髓鞘抗原活化的髓鞘抗原特異性T細胞，遷移至中樞神經系統。一旦進入中樞神經系統，這些活化的T細胞就會再次接觸髓鞘抗原，啟動炎癥免疫反應導致炎性脫髓鞘。在EAE發病過程中，MOG肽抗原特異性T細胞(MOG-T細胞)產生，進入中樞神經系統，引起臨床癥狀，而隨著MOG-T細胞進入中樞神經系統增加，小鼠脊髓炎性細胞浸潤和脫髓鞘加劇，疾病嚴重程度加重，因此疾病嚴重程度與中樞神經系統中浸潤的MOG-T細胞的數量關系密切。據此我們推測在EAE發病過程中，MOG-T細胞穿過血腦屏障遷移至中樞神經系統，破壞髓鞘釋放MOG肽，這一過程加速了T細胞的活化和遷移過程，進而加速胸腺中的T細胞發育過程，加速T細胞發育過程中的陽性選擇和陰性選擇，DP細胞凋亡加速，促使更多的成熟T細胞釋放到外周，接受抗原遞呈細胞遞呈的MOG肽，活化為MOG-T細胞遷移至中樞神經系統，形成正向的級聯放大效應。因此疾病嚴重程度可能決定胸腺萎縮程度，活化T細胞的遷移可能導致胸腺的萎縮。萎縮胸腺的可復性也早有報道[10]，對胸腺的可復性進行研究發現，隨著EAE小鼠病情的緩解，胸腺萎縮減輕，細胞凋亡減少，這進一步驗證了上面的結果。綜上所述，EAE小鼠疾病嚴重程度與胸腺萎縮程度關系密切，EAE小鼠中活化T細胞的定向遷移可能導致胸腺萎縮。

我們同時觀察到，在EAE小鼠發病高峰期胸腺淋巴細胞的CD4-CD8-雙陰性階段，隨著疾病嚴重程度的加重,雙陰性細胞比例呈現先升高后降低的趨勢，CD4-CD8-雙陰性細胞亞群凋亡在EAE小鼠中的變化是我們下一步研究的重點。

參考文獻：

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[3]Constantinescu CS,Farooqi N,O′Brien K,etal.Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) as a model for multiple sclerosis (MS)[J].Br J Pharmacol，2011，164(4):1079-1096.

[4]Hirokawa K,Utsuyama M,Kobayashi S.Hypothalamic control of development and aging of the thymus[J].Mech Ageing Dev，1998，100(2):177-185.

[5]Savino W,Dardenne M,Velloso LA,etal.The thymus is a common target in malnutrition and infection[J].Br J Nutr，2007，98(Suppl 1):S11-S16.

[6]Savino W.The thymus is a common target organ in infectious diseases[J].PLoS Pathog，2006，2(6):e62.

[7]Yoh K,Morito N,Ojima M,etal.Overexpression of RORgammat under control of the CD2 promoter induces polyclonal plasmacytosis and autoantibody production in transgenic mice[J].Eur J Immunol，2012，42(8):1999-2009.

[8]Martinez NE,Sato F,Omura S,etal.RORgammat,but not T-bet,overexpression exacerbates an autoimmune model for multiple sclerosis[J].J Neuroimmunol,2014,276(1-2):142-149.

[9]Harrington LE,Mangan PR,Weaver CT.Expanding the effector CD4 T-cell repertoire:the Th17 lineage[J].Curr Opin Immunol,2006,18(3):349-356.

[10]Zhang N,Hartig H,Dzhagalov I,etal.The role of apoptosis in the development and function of T lymphocytes[J].Cell Res，2005，15(10):749-769.

[收稿2015-03-20修回2015-06-05]

(編輯倪鵬)