降植烷誘導小鼠類風濕關節炎的模型①

陶云霞　蔡　磊　沈　輝　朱玉強　邱玉華　顧巧麗　耿德春　施　勤

(蘇州大學附屬第一醫院骨科，蘇州215006)

[摘　要]　目的：利用降植烷構建一種模擬人類風濕性關節炎發病過程的小鼠模型。方法：6~8周雌性BALB/c小鼠30只，隨機分為模型組和對照組，每組15只。模型組于0周、9周、18周時經腹腔注射0.5 ml降植烷；對照組注射0.5 ml生理鹽水。觀察各組小鼠后足足掌厚度變化，并對關節炎的腫脹程度進行評分；H&E染色評估滑膜增生和炎性細胞浸潤程度；流式細胞術方法檢測小鼠脾臟中巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、T細胞和B細胞的亞群變化。結果：21周時，模型組有11只小鼠出現足爪紅腫，足掌平均厚度為(2.90±0.51)mm，與對照組(1.29±0.47)mm比較，差異有統計學意義(P<0.05)；關節炎評分為9.55±2.80。H&E染色結果顯示模型組脛骨遠端骨小梁吸收破壞，累及骨皮質，關節軟骨可見壞死脫落、纖維化，呈現出明顯的類風濕關節炎病理改變。流式細胞術分析結果顯示，造模21周時，脾臟細胞中CD11b、CD11c和GR1表達明顯增加，提示巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞亞群數量增加；同時，CD4、CD8、CD154的分子表達也明顯上調，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：經腹腔注射降植烷能夠成功誘導小鼠關節炎，并產生與RA患者類似的組織病理和免疫學改變。降植烷誘導的小鼠關節炎模型，能夠較為準確地模擬臨床類風濕關節炎的發病過程。

[關鍵詞]　降植烷；類風濕關節炎；小鼠模型

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.012

降植烷誘導小鼠類風濕關節炎的模型①

陶云霞蔡磊②沈輝②朱玉強②邱玉華②顧巧麗耿德春施勤

(蘇州大學附屬第一醫院骨科，蘇州215006)

[摘要]目的：利用降植烷構建一種模擬人類風濕性關節炎發病過程的小鼠模型。方法：6~8周雌性BALB/c小鼠30只，隨機分為模型組和對照組，每組15只。模型組于0周、9周、18周時經腹腔注射0.5 ml降植烷；對照組注射0.5 ml生理鹽水。觀察各組小鼠后足足掌厚度變化，并對關節炎的腫脹程度進行評分；H&E染色評估滑膜增生和炎性細胞浸潤程度；流式細胞術方法檢測小鼠脾臟中巨噬細胞、樹突狀細胞、中性粒細胞、T細胞和B細胞的亞群變化。結果：21周時，模型組有11只小鼠出現足爪紅腫，足掌平均厚度為(2.90±0.51)mm，與對照組(1.29±0.47)mm比較，差異有統計學意義(P<0.05)；關節炎評分為9.55±2.80。H&E染色結果顯示模型組脛骨遠端骨小梁吸收破壞，累及骨皮質，關節軟骨可見壞死脫落、纖維化，呈現出明顯的類風濕關節炎病理改變。流式細胞術分析結果顯示，造模21周時，脾臟細胞中CD11b、CD11c和GR1表達明顯增加，提示巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞亞群數量增加；同時，CD4、CD8、CD154的分子表達也明顯上調，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結論：經腹腔注射降植烷能夠成功誘導小鼠關節炎，并產生與RA患者類似的組織病理和免疫學改變。降植烷誘導的小鼠關節炎模型，能夠較為準確地模擬臨床類風濕關節炎的發病過程。

[關鍵詞]降植烷；類風濕關節炎；小鼠模型

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.012

中圖分類號①本文受國家自然科學基金(No.81373236)和江蘇省骨科臨床醫學研究中心(BL2012004)資助。;②蘇州大學醫學部免疫系，蘇州215123。

作者簡介：陶云霞(1983年-)，女,主管技師，主要從事免疫學及醫學檢驗技術方面的研究，E-mail: taoyx8493@163.com。

通訊作者及指導教師：施勤(1971年-),女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事免疫學研究， E-mail: qshisz@126.com。

[Abstract]Objective:To establish a pristine-induced rheumatoid arthritis model in mice,and to evaluate its histological and immunological distinction.Methods: Thirty female BALB/c mice,6-8 weeks old,were randomly divided into 2 groups,a control group and pristine group.The mice in pristine group were injected intraperitoneally with 0.5 ml pristine three times at 0,9,and 18 weeks,while mice in the control group receiving saline at the same time.Arthritis score and paw thickness were measured and histopathological assessment of joint sections was performed.The expression of phagocytes,dendritic,neutrophils,T and B cells markers in spleen were determined by flow cytometry.Results: In model-marking group,11 mice were presented with macroscopic evidence of arthritis such as erythema or swelling.The paw thickness in pristine-induced mice was significant higher than that in the control groups[(2.90±0.51)mm vs(1.29±0.47 mm),P<0.05].In addition,arthritis score in pristine-induced mice was 9.55±2.80 at 21 weeks after first injection with 0.5 ml pristine.H&E staining revealed a significant increase of synovial inflammation,cartilage and bone destruction after stimulated with pristine.Meanwhile,the expression levels of CD11b,CD11c,GR1,CD4,CD8 and CD154 were obviously increased in model-marking group when compared with that in control group.Conclusion: The pristine-induced model presents the similar histological and immunological distinctions with human rheumatism arthritis,which can mimic the pathogenesis of rheumatism arthritis.

Pristine-induced rheumatoid arthritis model in mice

TAOYun-Xia,CAILei,SHENHui,ZHUYu-Qiang,QIUYu-Hua,GUQiao-Li,GENGDe-Chun,SHIQin.DepartmentofOrthopedics,theFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215006,China

[Key words]Pristine；Rheumatoid arthritis；Mouse model

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種以進行性、侵蝕性關節破壞為特征性病理改變的全身性自身免疫病。其基本病理改變主要是滑膜慢性炎癥及關節軟骨和骨質的破壞，臨床特征為關節結構的炎癥和腫脹、慢性進行性病程，并可致多個關節完全強直，最終導致功能的喪失，致殘率高[1]。因此，為臨床發病機制的研究及尋找新的診療手段，建立一種能準確模擬RA發病過程的動物模型尤為重要。目前，最為常用的RA模型為Ⅱ型膠原誘導的小鼠或大鼠模型，但其建模過程需要通過尾靜脈注射Ⅱ型膠原和佐劑的混合物，操作難度大[2]。降植烷是一種常用的致炎劑，有文獻報道其能不依賴于T或B細胞激活免疫系統引起免疫反應[3,4]。本文以BALB/c小鼠為研究對象，擬制備降植烷誘導的RA小鼠模型并對其免疫病理變化進行評價。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組6~8周雌性BALB/c小鼠30只，體質量25~30 g，由蘇州大學實驗動物中心提供。采用隨機數字表法分為模型組及對照組，每組15只。SPF級動物房常規飼養。實驗方案得到蘇州大學附屬第一醫院動物倫理委員會批準。

1.2主要試劑降植烷，即2,6,10,14-四甲基十五烷，購于美國Sigma公司 。PE標記抗小鼠抗體CD11b、CD11c、Gr1，FITC標記CD4、CD8、CD21、CD23、CD80、CD86、CD154(CD40L)，APC標記抗小鼠抗體B220均購置美國eBioscience公司。

1.3降植烷誘導RA小鼠模型的制備小鼠適應性飼養1周，造模組于0周、9周、18周時腹腔各注射0.5 ml降植烷；對照組于相同時間腹腔注射0.5 ml生理鹽水。第21周時，采用頸椎脫臼法處死小鼠，保留小鼠脾臟及雙側后肢關節，分別行免疫學及組織病理學檢測。

1.4小鼠足趾厚度的測定從第18周起，使用游標卡尺對小鼠同側的后足跗跖關節肉厚處進行測量，每周測量2次，每次重復測量3次，取平均值。所有測量由兩名實驗者獨立完成。

1.5關節炎指數評分(Arthritis index,AI)從第18周起，對各組小鼠關節腫脹程度進行評分，每周評測2次，每次重復測量3次，取平均值。采用關節炎評分法(0~4分)[5]，0分：無關節炎；1分：有紅色斑點或輕度腫脹；2分：關節部位中度腫脹；3分：嚴重腫脹；4分：嚴重腫脹且不能負重，四肢評分的和即為關節炎指數(最大分數16)。

1.6流式細胞檢測脾細胞免疫分子表達變化取小鼠脾臟制成單細胞懸液，5×105個細胞加入各流式分析管，分別加入PE標記抗小鼠抗體CD11b、CD11c、Gr1，FITC標記CD4、CD8、CD21、CD23、CD80、CD86、CD154(CD40L)，APC標記抗小鼠抗體B220 4℃避光孵育1 h，經洗滌，1%多聚甲醛固定，流式細胞儀分析細胞的免疫分子在脾臟細胞中的表達情況。

1.7組織學觀察小鼠處死后切取后肢膝關節，剔除皮毛和肌肉浸泡于4%甲醛溶液固定3 d，而后放入10%EDTA液中脫鈣30 d，常規石蠟包埋，4 μm切片，H&E染色，普通光鏡觀察。

2結果

2.1小鼠一般情況造模期間，小鼠無死亡。正常組小鼠精神狀態好，能正常爬行，關節活動自如，無紅腫；第三次注射免疫(18周)后，造模組有11只小鼠出現癥狀(成模率73.3%)，具體表現為足爪紅腫，體型消瘦，毛色雜亂稀疏，步態異常，倦怠易激惹；足部存在不同程度腫脹，關節增粗，黏膜紅腫滲出。見圖1。小鼠足掌厚度測量結果顯示，21周時模型組小鼠后足腫脹最為明顯，厚度為(2.90±0.51)mm，與對照組(1.29±0.47)mm比較，差異有統計學意義(t=-6.097；P<0.05)；關節炎評分結果顯示21周時11只成模小鼠中，有4只癥狀較輕，7只發病嚴重，關節炎指數為9.55±2.80。

2.2組織病理學觀察正常小鼠膝關節結構完整無損，無骨小梁吸收，關節軟骨光滑平整(圖2A)。模型組小鼠膝關節結構被破壞，有骨小梁吸收，關節軟骨可見壞死脫落，纖維化，關節腔狹窄。炎細胞大量浸潤，伴有程度不同的軟組織水腫(圖2B)。

圖1　21周時，小鼠右后肢大體改變Fig.1　Representative photographs of right hind paws of mice on week 21Note: A.Control group；B.Model-making group.

圖2　小鼠右后肢膝關節H&E染色結果(×20)Fig.2　Right ankle joints of mice obtained on week 21 were stained with haematoxylin and eosin(×20)Note: A.Control group;B.Model-making group.

表1　小鼠脾臟中巨噬細胞(CD11b+)、樹突狀細胞(CD11c+)和中性粒細胞(GR1+)的陽性率(%，±s，n=15)Tab.1　Expression level of phagocytes(CD11b+),dendritic(CD11c+)and neutrophils(GR1+)in spleen(%，±s，n=15)

表1　小鼠脾臟中巨噬細胞(CD11b+)、樹突狀細胞(CD11c+)和中性粒細胞(GR1+)的陽性率(%，±s，n=15)Tab.1　Expression level of phagocytes(CD11b+),dendritic(CD11c+)and neutrophils(GR1+)in spleen(%，±s，n=15)

GroupsCD11bCD11cGR1Controlgroup12.11±5.879.20±2.6410.08±5.014Model-makinggroup18.71±11.781)11.81±6.172)15.15±9.302)

Note：Compared to model-making group，1)P<0.05，2)P<0.01.

表2　脾臟T細胞中CD4、CD8a和CD154的表達(%，±s，n=15)Tab.2　Expression of CD4,CD8a and CD154 on T cell in spleen(%，±s，n=15)

表2　脾臟T細胞中CD4、CD8a和CD154的表達(%，±s，n=15)Tab.2　Expression of CD4,CD8a and CD154 on T cell in spleen(%，±s，n=15)

GroupsCD4CD8aCD154Controlgroup2.25±0.970.04±0.031.14±0.12Model-makinggroup21.5375±4.552)0.13±0.991)1.44±0.481)

Note：Compared to model-making group，1)P<0.05，2)P<0.01.

2.3小鼠脾細胞流式細胞檢測結果21周時取脾臟制成單細胞懸液，熒光抗體標記后經流式細胞儀檢測，結果顯示，模型組脾臟細胞中CD11b、CD11c和GR1表達明顯增加，提示吞噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞亞群數量增加(表1，P<0.05)。模型組中T細胞表面的表面標志CD4、CD8、CD154均有不同程度的增高，與對照組比較差異有統計學意義(表2，P<0.05)。模型組和對照組脾臟細胞中B220及CD21、CD23、CD80、CD86的表達未有明顯差異(P>0.05，結果未列出)。

3討論

類風濕性關節炎是一種累及全身關節的自身免疫性疾病，其病理特征是慢性炎細胞浸潤和滑膜增生，最終導致關節軟骨和骨質破壞[1]。迄今為止，RA發生的確切機制尚不清楚，還沒有有效的預防和治療方法，所以，建立一種能夠準確模擬人類RA發病過程的動物模型對研究RA病因及藥物治療至關重要。

降植烷，即2,6,10,14-四甲基十五烷，是葉綠素分解后的產物。有學者發現降植烷能促進小鼠B淋巴細胞瘤的發生[6]，而將降植烷經腹腔注射后能誘導產生狼瘡特異性抗體，實驗小鼠表現出明顯的系統性紅斑狼瘡的特征[7-9]。在本研究中，筆者將0.5 ml降植烷經腹腔注射給BALB/c小鼠，并在9周和18周時各補注1次，21周時實驗小鼠表現出明顯的關節炎癥狀，發病率為73.7%，與Potter等[10]報道一致。組織學染色發現，實驗小鼠關節滑膜增生明顯，有大量炎性細胞浸潤，以中性粒細胞和單核細胞為主，軟骨和骨組織破壞明顯，有血管翳形成，與人類RA患者病變關節組織病理改變類似。汪婷婷等[4]在降植烷誘導的大鼠關節炎模型中也發現了類似的病理改變。上述結果提示經腹腔注射降植烷能夠誘導小鼠產生關節炎病理改變。

有研究表明，T細胞尤其是CD4+T細胞在RA發病過程中起重要作用[11]。在RA滑膜浸潤的單核細胞中，30%～50%為T細胞，而且這些細胞多處于活化狀態，并且通過與巨噬細胞相互作用，引起軟骨和骨組織破壞[11-13]。筆者研究發現，降植烷免疫后的小鼠脾臟中CD4、CD8和CD154+T細胞數量明顯增多，提示降植烷可能通過調節T細胞引起小鼠關節炎病理改變。Holmberg等[3]的研究表明降植烷是一種非免疫原性的佐劑，不能被T細胞或B細胞特異性識別，降植烷致關節炎的能力也就取決于其對免疫系統的非特異性刺激引起的自身反應性T淋巴細胞活化，引起關節急性炎癥，隨后進入慢性進展和反復發作階段。因此，在免疫學特征方面，降植烷誘導的RA模型可能更類似于RA患者，更適于RA病理機制的研究。

B細胞在RA關節滑膜中的數量較少，但近年來的研究發現B細胞在RA發病機制中起重要作用[14]。Takemura等[15]證實RA滑膜中T細胞的激活和作用是B細胞依賴性的；B細胞作為一種抗原遞呈細胞，向T細胞提供共刺激信號；B細胞還能通過分泌TNF-α等炎癥因子、趨化因子以及類風濕因子等進一步加重RA關節破壞[16,17]。我們的結果顯示在降植烷誘導小鼠狼瘡性腎炎的起始階段可引起B細胞功能活化[7]，但是，在本研究中流式細胞檢測結果表明，降植烷免疫后的小鼠脾臟內B細胞表面標志CD21、CD23、CD80、CD86的表達未有明顯差異，我們推測B細胞功能在降植烷引起的后期免疫反應趨于穩定。

綜上所述，經腹腔注射降植烷能夠成功誘導小鼠關節炎，并產生與RA患者類似的免疫學改變，是一種可靠的RA動物模型，為探討RA的發病機制及尋找RA的診療的新技術新方法提供研究工具和物質基礎。

參考文獻：

[1]Shimizu T,Takahata M,Kameda Y,etal.Sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin 15(Siglec-15)mediates periarticular bone loss,but not joint destruction,in murine antigen-induced arthritis[J].Bone,2015，79:65-70.

[2]Asquith DL,Miller AM,McInnes IB,etal.Animal models of rheumatoid arthritis[J].Eur J Immunol,2009，39(8):2040-2044.

[3]Holmberg J,Tuncel J,Yamada H,etal.Pristane,a non-antigenic adjuvant,induces MHC class II-restricted,arthritogenic T cells in the rat[J].J Immunol,2006;176(2):1172-1179.

[4]汪婷婷,羅愛林,王金韜,等.降植烷誘導大鼠關節炎模型的建立及免疫學評價[J].中華風濕病學雜志,2008，28(4):318-321.

[5]Clark DN,Markham JL,Sloan CS,etal.Cytokine inhibition as a strategy for treating systemic lupus erythematosus[J].Clin Immunol,2013，148(3):335-343.

[6]Anderson PN,Potter M.Induction of plasma cell tumours in BALB-c mice with 2,6,10,14-tetramethylpentadecane(pristane)[J].Nature,1969，222(5197):994-995.

[7]高增燕,孫杰,王艷茹,等.降植烷誘導C57BL/J6狼瘡性腎病鼠模型的建立和生物學鑒定[J].蘇州大學學報：醫學版,2010，30(3):498-501.

[8]Zhuang H,Han S,Xu Y,etal.Toll-like receptor 7-stimulated tumor necrosis factor α causes bone marrow damage in systemic lupus erythematosus [J].Arthritis Rheumatol,2014，66(1):140-151.

[9]Satoh M,Reeves WH.Induction of lupus-associated autoantibodies in BALB/c mice by intraperitoneal injection of pristane [J].J Exp Med,1994，180(6):2341-2346.

[10]Potter M,Wax JS.Genetics of susceptibility to pristane-induced plasmacytomas in BALB/cAn:reduced susceptibility in BALB/cJ with a brief description of pristane-induced arthritis [J].J Immunol,1981，127(4):1591-1595.

[11]Kurokawa M,Kato T,Masuko-Hongo K,etal.Characterisation of T cell clonotypes that accumulated in multiple joints of patients with rheumatoid arthritis [J].Ann Rheum Dis,1999，58(9):546-553.

[12]Hao L,Zhu G,Lu Y,etal.Deficiency of cathepsin K prevents inflammation and bone erosion in rheumatoid arthritis and periodontitis and reveals its shared osteoimmune role[J].FEBS Lett,2015，589(12):1331-1339.

[13]焦志軍,尤海燕,陳蕾,等.類風濕性關節炎患者CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞檢測及意義[J].中國免疫學雜志,2007，23(10):936-938.

[14]Edwards JC,Szczepanski L,Szechinski J,etal.Efficacy of B-cell-targeted therapy with rituximab in patients with rheumatoid arthritis[J].N Engl J Med,2004，350(25):2572-2581.

[15]Takemura S,Klimiuk PA,Braun A,etal.T cell activation in rheumatoid synovium is B cell dependent[J].J Immunol,2001，167(8):4710-4718.

[16]Engelmann R,Wang N,Kneitz C,etal.Bone resorption correlates with the frequency of CD5 B cells in the blood of patients with rheumatoid arthritis[J].Rheumatology(Oxford),2015，54(3):545-553.

[17]Yeo L,Lom H,Juarez M,etal.Expression of FcRL4 defines a pro-inflammatory,RANKL-producing B cell subset in rheumatoid arthritis [J].Ann Rheum Dis,2015，74(5):928-935.

[收稿2015-07-11修回2015-08-26]

(編輯張曉舟)