慢性乙型肝炎患者中IL-37的水平與HBeAg血清轉換的關系研究

劉晶晶　李慶彥　管　珊　劉春華　賀玉凱　陶昌明

(聊城市人民醫院感染科，聊城252000)

[摘　要]　目的：觀察HBeAg陽性的慢性乙型肝炎(CHB)患者在接受替比夫定抗病毒治療期間外周血IL-37表達的變化與HBeAg血清學轉換的關系。方法：選取2013年9月至2014年1月在我科住院HBeAg陽性的CHB患者50例，健康對照組20例為本院健康志愿者。檢測各組血清中IL-37、IL-6、CRP的水平。并于0、12、24、36、48周動態觀察IL-37表達的變化與HBeAg血清學轉換的關系。結果：HBeAg陽性CHB患者血清中IL-37的表達水平顯著高于對照組(q=22.716，P<0.01)。經抗病毒治療后HBeAg血清學轉換患者中IL-37的表達水平較治療前明顯下降(t=-19.480，P<0.001)。IL-37與ALT、IL-6、CRP呈正相關性(r分別為0.697,0.725,0.895，P均<0.001)，與HBV DNA無相關性(r=0.136，P>0.05)。結論：在HBeAg陽性CHB患者中IL-37可能參與了HBV感染的過程，并能夠反映肝臟炎癥的程度。經過替比夫定抗病毒治療后，IL-37可能參與了HBeAg血清學轉換的過程。IL-37可作為慢性乙肝治療的一個新指標。

[關鍵詞]　慢性乙型肝炎；白細胞介素-37；替比夫定；HBeAg血清學轉換

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.023

慢性乙型肝炎患者中IL-37的水平與HBeAg血清轉換的關系研究

劉晶晶李慶彥管珊劉春華賀玉凱陶昌明

(聊城市人民醫院感染科，聊城252000)

[摘要]目的：觀察HBeAg陽性的慢性乙型肝炎(CHB)患者在接受替比夫定抗病毒治療期間外周血IL-37表達的變化與HBeAg血清學轉換的關系。方法：選取2013年9月至2014年1月在我科住院HBeAg陽性的CHB患者50例，健康對照組20例為本院健康志愿者。檢測各組血清中IL-37、IL-6、CRP的水平。并于0、12、24、36、48周動態觀察IL-37表達的變化與HBeAg血清學轉換的關系。結果：HBeAg陽性CHB患者血清中IL-37的表達水平顯著高于對照組(q=22.716，P<0.01)。經抗病毒治療后HBeAg血清學轉換患者中IL-37的表達水平較治療前明顯下降(t=-19.480，P<0.001)。IL-37與ALT、IL-6、CRP呈正相關性(r分別為0.697,0.725,0.895，P均<0.001)，與HBV DNA無相關性(r=0.136，P>0.05)。結論：在HBeAg陽性CHB患者中IL-37可能參與了HBV感染的過程，并能夠反映肝臟炎癥的程度。經過替比夫定抗病毒治療后，IL-37可能參與了HBeAg血清學轉換的過程。IL-37可作為慢性乙肝治療的一個新指標。

[關鍵詞]慢性乙型肝炎；白細胞介素-37；替比夫定；HBeAg血清學轉換

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2015.11.023

中圖分類號R392

文獻標志碼碼A

文章編號號1000-484X(2015)11-1545-05

作者簡介：劉晶晶(1982年-)，女，主治醫師，主要從事病毒性肝炎的免疫學研究，E-mail:liujingjing5556@163.com。

[Abstract]Objective:Detecting serum IL-37 concentrations and HBeAg seroconversion in chronic hepatitis B virus(HBV)patients during the treatment of telbivudine(LDT).Methods: Fifty patients with chronic hepatitis B were included in the study;and 20 healthy people were selected as the control group.The expression levels of interleukin(IL)-37,IL-6 and CRP were measured by enzyme-linked immunosorbent assay.As the same time,the relationship between serum IL-37 concentrations and HBeAg seroconversion was dynamically observed at 0 w,12 w,24 w,36 w,48 w after treatment.Results: The serum levels of IL-37 in chronic HBV patients were higher than the control group at baseline(q=22.716，P<0.01).The serum levels of IL-37 were decreased in HBeAg seroconverted CHB patients(t=-19.480，P<0.001).The levels of IL-37 were positively correlated with ALT,IL-6 and CRP(rwere 0.697,0.725,0.895，respectively;allP<0.001).The levels of IL-37 and HBV DNA was no correlation(r=0.136,P>0.05).Conclusion: IL-37 may be involved in the process of HBV infection in CHB patients,and can reflect the degree of liver’s inflammatory damage.IL-37 may play a significant role in the immune response of CHB patients with HBeAg seroconversion.In future,IL-37 may be an effective therapeutic measure to HBV infection.

Expression levels of IL-37 and HBeAg seroconversion in chronic HBV patients

LIUJing-Jing,LIQing-Yan,GUANShan,LIUChun-Hua,HEYu-Kai,TAOChang-Ming.InfectiousDiseases,LiaochengPeople'sHospital,Liaocheng252000，China

[Key words]Chronic hepatitis B；Interleukin-37；Telbivudine；HBeAg seroconversion

乙型肝炎病毒HBV感染是一個全球關注的健康問題，每年約有100多萬人死于肝炎病毒感染所致的肝硬化和肝細胞癌[1]。目前認為，CHB的發生發展中固有免疫和特異性免疫均發揮重要作用，大量的研究表明眾多細胞因子參與了CHB的發病過程。CRP、IL-6[2，3]等促炎因子在CHB的發生發展中具有重要作用，與肝臟炎癥程度有相關性。IL-37是近年剛發現的IL-1家族新成員，它的表達與免疫細胞和炎癥反應密切相關。IL-37在CHB中的表達水平及所起的作用，目前尚無相關報道。本研究旨在通過檢測IL-37在HBeAg陽性的CHB患者外周血中的表達水平，分析其與HBeAg血清學轉換的關系，并觀察與ALT、HBV DNA、IL-6、CRP臨床指標的相關性。

1材料與方法

1.1研究對象隨機抽取2013年9月至2014年1月在我科門診及住院的CHB患者50例，其中男性30例，女性20例，平均年齡35.7歲。均接受替比夫定抗病毒治療。入組患者診斷均符合《2010年版慢性乙型肝炎防治指南》[4]，且有抗病毒治療指征[4]。入組條件：明確診斷為慢性乙型肝炎，且HBeAg陽性。既往無應用干擾素或核苷類似物抗病毒治療史，并排除其他嗜肝病毒重疊感染，無藥物性肝損害、酒精性肝損害，脂肪肝等其他肝病，無腫瘤、糖尿病、自身免疫性疾患、嚴重器質性病變等。同期的正常對照組20例為本院查體中心健康志愿者。其中男性12例，女性8例，平均年齡38.9歲。入組標準血常規、生化全項正常，既往無自身免疫性疾病、腫瘤、嚴重器質性病變等疾病病史。所有患者入組半年內未使用過激素、免疫抑制劑等。兩組間年齡、性別比例之間無統計學差異。

1.2治療方法給予所有患者替比夫定(600 mg/d qd)、異甘草酸鎂(0.1 g/d qd)、還原性谷胱甘肽(2.4 g/d qd)等保肝對癥支持治療。

1.3研究方法入組患者分別于第0周、12周、24周、36周、48周清晨采集空腹外周靜脈血5ml，用酶聯免疫吸附法檢測患者血清IL-37、IL-6、CRP的表達水平；用全自動生化分析儀檢測ALT和AST；用電化學發光法檢測HBsAg、HBeAg、HBeAb；用熒光定量聚合酶鏈反應法(PCR)檢測HBV DNA。IL-37 ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、CRP ELISA試劑盒均購自瑞士AdipoGen公司，HBeAg試劑盒購自美國Abbott公司，QIAamp DNA提取試劑盒購自德國Qiagen公司。

1.4統計學方法使用Excel表格和SPSS19.0統計軟件處理實驗數據，計量資料結果采用±s表示，兩組間的比較采用t檢驗，多個均數比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，由Excel表計算q值。組間相關性分析采用Spearman法。P<0.05，則認為數據差異有統計學意義。

2結果

2.1CHB組在治療前與對照組及CHB組治療前與肝功能復常或接近正常后(12周時)各指標表達水平的比較見表1CHB組在治療前ALT、AST、IL-37、IL-6、CRP分別與對照組相比差異均有統計學意義(q分別為13.990、11.367、22.716、24.700、26.623，P均<0.01)。經過保肝、抗病毒治療至12周時ALT、AST、 IL-6和CRP的表達水平恢復至正常水平，IL-37的表達水平較治療前下降，差異有統計學意義(q=4.295,P<0.01)，但仍高于對照組基線水平，差異有統計學意義(q=19.469,P<0.01)。

2.2HBeAg血清學轉換組與未轉換組IL-37表達水平的動態變化見圖1在觀察期間13例出現HBeAg血清學轉換(其中觀察至12周時未有出現HBeAg血清學轉換的患者，觀察至24周時共出現2例，觀察至36周時共出現8例，觀察至48周時共出現13例HBeAg血清學轉換的患者和1例HBeAg轉陰的患者)。將這13例出現HBeAg血清學轉換和1例HBeAg轉陰的分為1組，其余未出現HBeAg血清學轉換的36例分為1組。分別于0、12、24、36、48周動態觀察兩組IL-37表達水平的變化。HBeAg血清學轉換組不同時間點間IL-37表達水平差異有統計學意義(F=68.872，P<0.001)，且IL-37的表達呈下降趨勢，其中12、24、36、48與0周相比差異均有統計學意義(t值分別為-3.794、-8.258、-10.525、-19.480，P均<0.01)。HBeAg血清學未轉換組0、12、24、36、48周之間IL-37表達水平差異無統計學意義(F=1.732，P>0.05)。其中12與0周相比差異有統計學意義(t=-7.705，P<0.001)，而24、36、48與0周相比差異均無統計學意義(t值分別為-1.530，-1.111，-0.984，P均>0.05)。 其中HBeAg血清學轉換組中HBVDNA的動態變化與IL-37一致，呈下降趨勢，且組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，與健康對照組比較均有顯著性差異(P均<0.001)。HBeAg血清學轉換組中HBsAg檢測水平無明顯變化，組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，與健康對照組比較差異均有顯著性(P均<0.001)。HBeAg血清學轉換組中ALT的檢測水平逐漸恢復或接近正常水平，其中0、12、24周、健康對照組組間比較差異均有統計學意義(P均<0.05)，24、36、48周、健康對照組組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。

Note：1)P<0.01,vs control group；2)P<0.01，vs after the treatment(12 w).

圖2　IL-37表達水平與ALT、IL-6、CRP的相關性Fig.2　Relationship between expression level of IL-37 and ALT,IL-6,CRP

2.3IL-37表達水平與ALT、HBV DNA、IL-6、CRP相關性分析見圖2IL-37的表達水平與ALT、IL-6、CRP呈正相關性(r分別為0.697，0.725，0.895，P均<0.001)，IL-37表達水平與HBV DNA無相關性(r=0.136，P>0.05)。

3討論

我國是乙肝大國，成人感染HBV后有5%~10%的人容易發展為慢性乙型肝炎[5]。一旦發展成慢性肝炎會進展成威脅生命的并發癥如肝硬化、肝癌等[6]。目前抗病毒被視為可阻止病情進展的最重要的治療，HBeAg的血清學轉換是用來評估HBeAg陽性的CHB患者抗病毒治療療效的工具，被視為滿意的治療終點[7]。大量臨床研究證明，替比夫定有著較高的HBeAg血清學轉換率。在HBV感染清除過程中免疫細胞和大量細胞因子起了重要作用，IL-37作為一種新型的炎性因子，在細胞水平已經證實，能調節多種不同功能炎性因子的表達，在多種疾病中起抗炎作用[8]。然而，我們對IL-37在慢性乙型肝炎中所起的作用尚不明確。因此本研究就慢性乙型肝炎應用替比夫定抗病毒過程中IL-37的表達水平動態變化進行探討，以期發現它與HBeAg血清學轉換的關系，為臨床抗病毒治療尋找新的思路。

IL-37是最新發現的能調節炎癥因子表達的IL-1家族成員，2000年Kumar等[9]首先報道了這個細胞因子,初步闡述了其結構及功能。2010年研究者對其作用機制有了新的認識，將其正式命名為IL-37[8]。目前對IL-37的功能仍不十分清楚。IL-37參與多種炎癥性疾病的發生發展，在免疫性疾病和感染性疾病中起重要作用。IL-37的表達在內毒素血癥、自身免疫性疾病中都有重要作用[8,10-12]。Bulau等[13]發現IL-37在肝臟炎性疾病中具有一定保護作用。

本研究中發現CHB患者中IL-37的表達水平明顯高于健康對照組。且IL-37的表達水平與ALT呈正相關。因此我們推測在HBV感染中IL-37可能參與了免疫反應過程，對肝臟炎癥有一定的保護作用。此研究結果與Li等[14]學者研究結果一致。當HBV病毒感染時，IL-37的表達水平是如何升高對肝臟炎癥進行保護的，我們分析可能通過以下兩個途徑實現：一方面HBsAg和HBV DNA作為Toll樣受體的配體，與之結合后，誘導肝細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞、NK和NKT細胞分泌IFN-α、IFN-β、IFN-γ，進一步激活肝臟巨噬細胞分泌TNF-α、IL-6和IL-1β，從而對HBV DNA病毒的復制進行抑制[15-17]。IL-18、IL-1β、IFN-γ和TNF-α等促炎細胞因子能促進IL-37的合成，Toll樣受體的配體可以上調人外周血中單核細胞(PBMC)中IL-37的表達[18-20]。HBsAg和HBV DNA作為Toll樣受體的配體，既往有研究證明了他們可以誘導IL-37的表達[14]；另一方面HBV病毒侵犯肝臟組織的同時，也侵犯PBMC，PBMC被HBV感染后受到CD8+T(CTL)細胞的攻擊，其中Th1和Th2細胞免疫功能降低，CD4+/CD8+比值下降，使細胞因子的表達失衡，導致病毒復制和肝細胞損傷[21,22]。以上兩個途徑均上調IL-37的合成，合成的IL-37對上述細胞因子又有抑制作用。

本研究中發現如表1，抗病毒治療12周后ALT、AST恢復正?；蚪咏?，IL-6和CRP恢復正常，IL-37也下降與治療前相比差異有統計學意(q=4.295,P<0.01)，仍高于對照組基線水平(q=19.469,P<0.01)，說明IL-37表達水平除與肝功能有關外，還受其他因素影響。隨之觀察至48周對HBeAg血清學轉換組與未轉換組IL-37表達水平的進行動態觀察發現如圖1，經過替比夫定抗病毒后，HBeAg血清學轉換組的患者血清中IL-37的表達水平和治療前對比明顯下降(t=-19.480，P<0.001)。而未轉換組IL-37的表達水平無明顯變化。動態觀察HBeAg血清學轉換組0、12、24、36、48周之間IL-37表達水平差異有統計學意義(F=68.872，P<0.001)；其中12、24、36、48周與0周相比差異均有統計學意義(P均<0.001)。此研究結果與LiCong等[14]學者研究結果一致。因此我們推測IL-37可能參與了HBeAg血清學轉換的免疫反應。經過替比夫定抗病毒治療后，隨著HBeAg的血清學轉換的出現、肝功能的恢復，IL-37的表達水平也逐漸恢復正常。有研究發現血漿樹突狀細胞、Toll樣受體和程序凋亡細胞-1可能與HBeAg的血清學轉換有關[23]。在替比夫定抗病毒過程中IL-37隨HBeAg血清學轉換的出現而降低的機制尚不明確。這可能與以下因素有關：替比夫定對NK、巨噬細胞及Toll樣受體等具有調節作用[24-26]，使機體的免疫系統逐漸恢復，誘導HBeAb的產生，經過替比夫定抗病毒的患者，HBV DNA復制下降導致CTL細胞對肝細胞的損傷減少，因此肝功能指標ALT、AST等逐漸恢復正常。HBV DNA復制的下降和肝損傷程度的減輕均使IL-37的表達下降。 IL-6是一種促炎的因子,可誘導肝臟產生CRP，CRP是反映機體炎癥的一項簡單而重要的指標。本研究發現IL-37、IL-6和CRP在CHB患者中均高表達，且均明顯高于對照組(P均<0.01)，既往已有大量研究表明IL-6、CRP的表達與CHB患者肝功能損傷大小有關。本研究如圖2所示IL-37的表達水平與ALT、IL-6、CRP呈正相關性(r分別為0.697，0.725，0.895，P均<0.001)。說明IL-37的表達與肝功能損傷程度有關。雖然HBsAg和HBV DNA作為Toll樣受體的配體，他們可以誘導IL-37的表達，但是本研究中IL-37與HBV DNA無相關性(r=0.136，P>0.05)，我們推測可能其他因素也影響了血清 IL-37 的表達水平。 綜上所述，本研究發現IL-37表達水平在HBeAg陽性CHB患者中明顯高于健康對照組，IL-37可能參與HBV感染過程。經過替比夫定抗病毒治療后，IL-37在HBeAg血清學轉換的患者中表達水平明顯低于治療前，我們推測IL-37可能參與了HBeAg血清學轉換的免疫反應。且IL-37的表達水平與ALT、IL-6、CRP呈正相關性，說明IL-37的表達與肝功能損傷程度有關。因此IL-37可作為慢性乙肝治療的一個新指標，為HBV感染的治療提供新的思路。

參考文獻：

[1]Lok AS.Chronic hepatitis B[J].N Engl J Med,2002,346(22):1682-1683.

[2]鄒美銀，朱勇根，章幼奕，等.慢性乙型肝炎和肝衰竭患者血清IL-32、IL-6、IL-8檢測及其意義[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2014,28(1)：F0002.

[3]高國生，朱海超，胡愛榮，等.乙型肝炎病毒對超敏C反應蛋白表達的影響及其臨床意義[J].中華微生物和免疫學雜志，2011，31(10)：931-933.

[4]中華醫學會肝病學分會，中華醫學會感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)[J].肝臟，2011，16：2-16.

[5]Mahoney FJ.Update on diagnosis,management,and prevention of hepatitis B virus infection[J].Clin Microbiol Rev,1999,12(2):351-366.

[6]Liaw YF,Chu CM.Hepatitis B virus infection[J].Lancet,2009,373(9663):582-592.

[7]He D,Yan G,Wang Y.Serum levels of interleukin-12 in various clinical states with hepatitis B virus infection[J].Cell Immunol,2012,272(2):162-165.

[8]Nold MF,Nold-Petry CA,Zepp JA,etal.IL-37 is a fundamental inhibitor of innate immunity[J].Nat Immunol，2010,11(11):1014-1022.

[9]Kumar S,McDonnell PC,Lehr R,etal.Identification and initial characterization of four novel members of the interleukin-1 family[J].J Biol Chem,2000,275(14):10308-10314.

[10]Boraschi D,Lucchesi D,Hainzl S,etal.IL-37:a new anti-inflammatory cytokine of the IL-1 family[J].Eur Cytokine Netw,2011,22(3):127-147.

[11]Akdis M,Burgler S,Crameri R,etal.Interleukins,from 1 to 37,and interferon-gamma:receptors,functions,and roles in diseases[J].J Allergy Clin Immunol,2011,127(3):701-721.

[12]McNamee EN,Masterson JC,Jedlicka P,etal.Interleukin 37 expression protects mice from colitis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2011,108(40):16711-16716.

[13]Bulau AM,Fink M,Maucksch C,etal.In vivo expression of interleukin-37 reduces local and systemic inflammation in concanavalin A-induced hepatitis[J].Scientific World J,2011,11:2480-2490.

[14]Li C,Ji H,Cai Y,etal.Serum interleukin-37 concentrations and HBeAg seroconversion in chronic HBV patients during telbivudine treatment[J].J Interferon Cytokine Res,2013,33(10):612-618.

[15]Watashi K,Liang G,Iwamoto M,etal.Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha trigger restriction of hepatitis B virus infection via a cytidine deaminase activation-induced cytidine deaminase(AID)[J].J Biol Chem,2013,288(44):31715-31727.

[16]Hosel M,Quasdorff M,Wiegmann K,etal.Not interferon,but interleukin-6 controls early gene expression in hepatitis B virus infection[J].Hepatology，2009,50(6):1773-1782.

[17]Thompson AJ,Locarnini SA.Toll-like receptors,RIG-I-like RNA helicases and the antiviral innate immune response[J].Immunol Cell Biol,2007,85(6):435-445.

[18]Fraczek J,Kim TW,Xiao H,etal.The kinase activity of IL-1 receptor-associated kinase 4 is required for interleukin-1 receptor/toll-like receptor-induced TAK1-dependent NFkappaB activation[J].J Biol Chem,2008,283(46):31697-31705.

[19]Bufler P,Azam T,Gamboni-Robertson F,etal.A complex of the IL-1 homologue IL-1F7b and IL-18-binding protein reduces IL-18 activity[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(21):13723-13728.

[20]李聰,蔣艷芳.IL-37的研究新進展[J].中國免疫學雜志,2013,28(7)：659-661.

[21]Tang YM,Chen MH,Chen GH,etal.Kinetics of phytohemaglutinin-induced IFN-gamma and TNF-alpha expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with chronic hepatitis B after liver transplantation[J].World J Gastroenterol,2005,11(29):4574-4578.

[22]Pontisso P,Vidalino L,Quarta S,etal.Biological and clinical implications of HBV infection in peripheral blood mononuclear cells[J].Autoimmun Rev,2008,8(1):13-17.

[23]Lau GK,Wang FS.Uncover the immune biomarkers underlying hepatitis B e antigen(HBeAg)seroconversion:a need for more translational study[J].J Hepatol,2012,56(4):753-755.

[24]Zeuzem S,Gane E,Liaw YF,etal.Baseline characteristics and early on-treatment response predict the outcomes of two years of telbivudine treatment of chronic hepatitis B [J].J Hepatol,2009,51(1):11-20.

[25]Chen Y,Li X,Ye B,etal.Effect of telbivudine therapy on the cellular immune response in chronic hepatitis B[J].Antiviral Res,2011,91(1):23-31.

[26]Wang GQ,Ding YP,Dong YH.Telbivudine treatment is associated with high hepatitis B e antigen seroconversion and immune modulatory effects in chronic hepatitis B patients [J].J Viral Hepat,2013,20(Suppl 1):9-17.

[收稿2015-03-20修回2015-05-07]

(編輯張曉舟)