心血管病中醫證候蛋白質組學研究概述

欒依含，劉先利，宗文靜，曹洪欣

(1．黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040;2．中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700; 3．首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069;4．國家中醫藥管理局，北京 100027)

心血管病中醫證候蛋白質組學研究概述

欒依含1，劉先利2，宗文靜3，曹洪欣4△

(1．黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040;2．中國中醫科學院中醫基礎理論研究所，北京 100700; 3．首都醫科大學中醫藥學院，北京 100069;4．國家中醫藥管理局，北京 100027)

證候是中醫診療的關鍵，蛋白質組學技術的興起與發展為中醫證候的基礎研究提供了有力的檢測手段。心血管疾病是危害人類健康的一大類疾病，開展心血管疾病中醫證候蛋白質組學的研究已得到廣泛關注。故通過對近年來心血管疾病中高發病率的冠心病和高血壓病證候蛋白質組學實驗研究和臨床研究文獻進行梳理和分析，總結歸納蛋白質組學在心血管疾病中醫證候研究中的進展，為心血管疾病中醫證候的進一步客觀化研究提供參考。

心血管疾病;中醫證候;蛋白質組學

蛋白質組學技術的興起與發展，為中醫證候的基礎研究提供了有力的檢測手段。蛋白質組學整體性、動態性、階段性、穩定性和復雜性特征與中醫證候特點十分相似［1］，將蛋白質組學技術與中醫證候研究相結合，不僅能明確證候的物質基礎，還能進一步了解證候表現的物質差異程度，從中醫的角度提高客觀、準確地認識疾病的發生發展規律，有助于對疾病辨證論治。中醫藥治療心血管疾病具有一定優勢，證候是中醫診療的關鍵，開展心血管疾病中醫證候蛋白質組學研究已得到廣泛關注，并取得階段性成果，現分析如下。

1 文獻檢索及篩選

在中國知網(CNKI)、萬方醫學網進行檢索，首先以“蛋白質組學”為關鍵詞進行第1次檢索;其次，中國知網以“主題”為檢索條件，萬方醫學網以“疾病”為檢索條件，分別對“心血管病”、“冠心病”、“高血壓”、“心力衰竭”、“心肌病”、“心律失常”、“瓣膜病”進行第2次檢索。在此基礎上對每篇文獻的題目、摘要進行篩選，選取與證候相關文獻進一步全文閱讀，并排除同一作者或同一團隊重復發表的論文。

篩選結果顯示，應用蛋白質組學技術對心血管病中醫證候的研究集中在冠心病和高血壓病，多以一病一證、同病異證研究為主，亦有從疾病發展階段變化入手。研究對象多為病證結合動物模型下的組織、血清樣本和人體血清/血漿樣本，是心血管病中醫證候蛋白質組學的主要研究熱點及研究內容［2］。

2 蛋白質組學在冠心病證候研究中的應用

冠心病證候蛋白質組學研究以血瘀證和痰瘀證為主，一病一證多見。蛋白質組學技術以經典的雙向凝膠電泳聯合質譜技術為主，新興的同位素體內/體外、標記/無標記定量蛋白質組學技術少有。同病同證各研究結果不盡相同，但各證型涉及的生物過程多與炎癥反應、抗氧化應激、凝血系統異常、脂質代謝紊亂等相關。

2.1 病證結合實驗研究

病證動物模型是聯系基礎研究與臨床實踐的重要橋梁，冠心病證候動物模型蛋白質組學研究主要包括血瘀證、氣虛血瘀證、氣滯血瘀證和痰瘀互結證。

2.1.1 血瘀證 郭淑貞［3］應用雙向電泳結合質譜技術對小型豬冠心病血瘀證模型血漿進行了蛋白質組學研究，鑒定出與炎癥反應、補體系統以及脂質轉運過程相關的7種蛋白，推測炎癥/抗炎病理過程可能是血瘀證的核心環節。王勇［4］進一步對小型豬心肌組織進行蛋白檢測，鑒定出過氧化酶等4種差異蛋白，認為其機制可能與機體抗氧化能力下降以及心肌結構損傷密切相關。

2.1.2 氣虛血瘀證 苗蘭等［5］應用雙向電泳結合質譜技術分離鑒定氣虛血瘀證大鼠血清的差異表達蛋白，得到CD5抗原樣蛋白等5種，認為其機制與炎癥反應、抗氧化作用、脂質降解調控、抗凝及凝血、免疫調控等相關。劉濤等［6］應用雙向電泳結合質譜技術對氣虛血瘀證大鼠缺血心肌組織進行差異蛋白檢測，鑒定出蘋果酸脫氫酶等8個差異蛋白，認為其機制可能與能量代謝障礙、應激反應和氧化損傷等因素有關。

2.1.3 氣滯血瘀證 苗蘭［7-8］應用雙向電泳結合質譜技術對氣滯血瘀證大鼠血清進行了2次差異蛋白檢測，分別鑒定出與JAK-STAT通路相關的2種蛋白與凝血及免疫反應相關的3種蛋白。JAKSTAT通路與缺血再灌注的心肌保護和心功能障礙密切相關。

2.1.4 痰瘀互結證 李欣志［9］應用雙向電泳結合質譜技術對小型豬冠心病痰瘀互結證模型血清進行了差異蛋白檢測，鑒定出與免疫、炎癥反應以及脂質代謝過程相關的C4BP等2種蛋白。苗蘭［7，10］進一步對小型豬冠心病痰瘀互結證模型的冠狀動脈和心肌組織檢測，在冠脈組織中鑒定出apoA-I等6種差異蛋白，在心肌組織中鑒定出Hsc70等4種差異蛋白，認為這些蛋白參與了炎癥反應、脂質代謝、免疫調控、抗細胞凋亡、抗氧化應激、血栓形成及內皮機制障礙等。

2.2 病證結合臨床研究

血清/血漿內含有生物信息豐富的高、中、低豐度蛋白且易于采集，是冠心病證候蛋白質組學研究的熱點領域。證候分型主要包括血瘀證、氣虛血瘀證、痰瘀互阻證等。

2.2.1 血瘀證 馬增春、吳紅金［11-12］應用雙向電泳結合質譜技術對冠心病血瘀證患者血漿進行蛋白標記物檢測，鑒定出粒酶等4種差異蛋白，認為其機制可能與機體內凝血異常以及血管內皮細胞凋亡有關。周倩倩等［13-14］應用雙向電泳結合質譜技術對陳舊性心肌梗死、冠心病血瘀證病人血清進行差異蛋白檢測，分別鑒定出CD5L等5種、APOA-I等4種差異蛋白，認為其機制主要涉及炎癥反應和脂質代謝兩方面。趙慧輝等［15-16］應用差異凝膠電泳結合質譜技術、液相色譜結合質譜技術對冠心病不穩定心絞痛血瘀證患者血漿進行蛋白質組學研究，分別鑒定出Transthyretin等9種、ACTA1等28種差異蛋白，認為其機制主要涉及心肌損傷、凝血系統異常、炎癥反應、氧運輸障礙和脂質代謝紊亂等。并進一步應用差異凝膠電泳結合質譜技術對冠心病不穩定性心絞痛血瘀證患者血瘀證前后程度變化的血漿進行差異蛋白檢測，鑒定出Clusterin等6種差異蛋白，認為其機制可能與氧化應激損傷、凝血纖溶系統異常、炎癥反應和脂質代謝紊亂等有關［17］。劉玥［18］對前期鑒定出的冠心病血瘀證血小板差異蛋白Gelsolin進行了ELISA法與WB法檢測，進一步證明血小板Gelsolin可能是冠心病血瘀證的特異生物標記物。

2.2.2 氣虛血瘀證 趙慧輝等［19-21］應用雙向電泳、差異凝膠電泳串聯質譜技術、液相色譜串聯質譜技術對冠心病氣虛血瘀證患者血漿進行差異蛋白檢測，分別鑒定出α1酸性糖蛋白等8種、α1抗胰蛋白酶等9種、肌動蛋白等12種差異蛋白，認為其機制可能與炎癥反應、脂質代謝障礙、心肌損傷、血氧代謝紊亂和凝血因子異常等相關。

2.2.3 痰瘀互阻證 趙慧輝等［22-23］應用雙向電泳、差異凝膠電泳串聯質譜技術對冠心病痰瘀互阻證患者血漿進行差異蛋白質組學研究，分別鑒定出ApoA-IV等6種、甲狀腺素轉運蛋白等14種差異蛋白，認為其機制可能與炎癥反應、脂質代謝障礙、血氧代謝紊亂等有關。

2.2.4 心腎陰虛證與心氣虛證 袁宏偉等［24］應用雙向電泳聯合質譜技術對冠心病心腎陰虛證、心氣虛證患者血清進行蛋白質組學研究，鑒定出凝血酶原等21種差異蛋白。這些蛋白主要涉及凝血、補體、脂質代謝、細胞凋亡、激肽釋放酶-激肽系統和Wnt途徑，可能是區別冠心病心腎陰虛證與心氣虛證的差異蛋白。

2.2.5 痰濁內阻證與心氣虛證 崔佩佩等［25］應用差異凝膠電泳聯合電噴霧質譜技術對冠心病痰濁內阻證、心氣虛證患者血清進行蛋白質組學研究，鑒定出載脂蛋白H等12種差異蛋白。這些蛋白主要涉及磷酸戊糖途徑、半乳糖代謝、糖酵解、血液連鎖反應系等通路，可能是區別冠心病痰濁內阻證與心氣虛證的差異蛋白。

2.2.6 心血瘀阻證與心腎陰虛證 王剛等［26］應用差異凝膠電泳結合質譜技術對冠心病心血瘀阻證和心腎陰虛證進行差異蛋白質組學研究，鑒定出聚集素等10種差異蛋白。這些蛋白主要涉及阿爾茨海默病通路、補體通路和凝血級聯通路，可能是區別冠心病心血瘀阻證與心腎陰虛證的差異蛋白。

2.2.7 心血瘀阻證與痰濁內阻證 朱明丹等［27］應用差異凝膠電泳結合質譜技術對冠心病心血瘀阻證和痰濁內阻證進行差異蛋白質組學研究，鑒定出抗凝血酶Ⅲ等10種差異蛋白。這些蛋白主要涉及凝血通路、補體通路、脂質代謝及炎癥反應過程，可能是區別冠心病心血瘀阻證與痰濁內阻證的差異蛋白。

2.2.8 冠心病不同階段研究 周倩倩［28］應用雙向電泳聯合質譜技術研究冠心病4個不同階段的血清蛋白質表達差異，共鑒定出載脂蛋白E等7個差異蛋白。這些蛋白主要參與炎癥反應、脂質代謝和氧化損傷等過程。尚青華［29］應用質譜技術對“冠心病穩定期血瘀證-潛毒-瘀毒”過程進行血清蛋白質組學研究，鑒定出“瘀毒”病機轉變蛋白KNG1等4種。認為其病機轉變過程與炎癥反應機制、激活凝血纖溶系統、氧化應激反應、緩激肽作用和血管內皮損傷等有關。

3 蛋白質組學在高血壓病證候研究中的應用

高血壓病證候蛋白質組學研究涉及一病一證、同病異證以及方證相關3方面。蛋白質組學技術以經典的雙向凝膠電泳聯合質譜技術為主，部分研究涉及生物過程及機制的分析，但尚需進一步深化研究。

3.1 病證結合實驗研究

高血壓病證候蛋白質組學實驗研究包括病證結合動物模型和血管內皮細胞損傷模型，包括肝陽上亢證、血瘀證和氣虛血瘀證。

3.1.1 肝陽上亢證 張鶯等［30］應用質譜技術在高血壓肝陽上亢證模型大鼠腎上腺組織鑒定出鐵輕鏈蛋白等7種蛋白，認為其機制可能與能量代謝和抗氧化障礙等相關。胡小勤等［31］應用雙向電泳技術對高血壓病肝陽上亢證患者血清細胞模型進行研究，發現25個差異蛋白點，認為這些變化的蛋白點可能與發生機制有關。

3.1.2 血瘀證 孫喜穩等［32］應用雙向電泳結合質譜技術對高血壓病血瘀證致傷的人臍靜脈內皮細胞進行了蛋白質組學研究，鑒定出谷氨酸脫氫酶等7種差異蛋白，認為這些蛋白可以作為物質基礎進行單克隆細胞模型研究。

3.1.3 氣虛血瘀證 胡小勤等［33］應用雙向電泳結合質譜技術對高血壓病氣虛血瘀證患者血清進行差異蛋白檢測，鑒定出肽基脯氨酰異構酶A等9種差異蛋白。認為其機制可能與細胞凋亡有關。進一步又對高血壓病氣虛血瘀證和肝陽上亢證細胞模型進行差異表達蛋白比較，篩選出27差異蛋白點作為區分二者的分子基礎［34］。

3.2 病證結合臨床研究

高血壓病證候蛋白質組學臨床研究以人血清和外周血單核細胞為主，包括肝陽上亢證、肝陽化風證、陰虛陽亢證、肝膽濕熱證和痰濕壅盛證。

3.2.1 肝陽上亢證 何青［35］應用質譜技術對高血壓病肝陽上亢證患者血清進行了蛋白質組學研究，依據判別函數從221個顯著差異蛋白峰中篩選出5個最佳峰值，組成了區分高血壓病肝陽上亢證的證候診斷模型。

3.2.2 肝陽化風證 熊新貴等［36］應用雙向電泳結合質譜技術對高血壓病肝陽化風證患者血清進行了蛋白質組學研究，鑒定出銅藍蛋白等5個差異蛋白。蕭梅芳等［37］進一步對高血壓腦出血肝陽化風證、高血壓病肝陽上亢證患者外周血單個核細胞比較，鑒定出與細胞凋亡、蛋白信號傳導、血小板活化、氧化應激等有關的21個差異蛋白，并推測抗氧化和抗凋亡能力代償性增強可能是肝陽上亢證發展至肝陽化風證的原因。楊波等［38］對高血壓病腦出血急性期肝陽化風證患者外周血單個核細胞進行了差異蛋白檢測，鑒定出肌動蛋白等3種差異蛋白，這些蛋白與細胞骨架、凝血及炎癥反應相關。

3.2.3 陰虛陽亢證 何青［35］應用質譜技術對高血壓病陰虛陽亢證患者血清進行了蛋白質組學研究，依據判別函數從145個顯著差異蛋白峰中篩選出5個最佳峰值組成了區分高血壓病陰虛陽亢證的證候診斷模型。褚瑜光［39］亦應用BPS決策判別軟件篩選出與高血壓病陰虛陽亢證發病機制相關的124個差異蛋白峰。

3.2.4 肝膽濕熱證和痰濕壅盛證 褚瑜光等［40-41］采用弱陽離子納米磁球和質譜聯用技術對高血壓病肝膽濕熱證與痰濕壅盛證患者血清進行了證候模型蛋白質組學研究，從182個差異蛋白峰中篩選出5個最佳峰值組成了高血壓病肝膽濕熱證診斷模型;從102個差異蛋白峰中篩選出4個最佳峰值組成了高血壓病痰濕壅盛證診斷模型。

4 問題與展望

蛋白質組學的興起為研究生命活動和疾病的發生發展規律提供了新方法，將其與中醫藥研究相結合，為中醫藥創新與現代化發展拓寬了途徑。然而蛋白質組學技術尚存在一定局限，用于中醫證候研究也存在一些問題:一是蛋白質組學研究檢測方法不同，儀器設備不同，使其結果無法統一;二是生物樣本的個體差異性，臨床研究樣本量較少，難以把握規律;三是目前研究多集中在一病一證和同病異證，異病同證的研究開展得較少;四是現階段幾乎所有蛋白質組學研究只進行到發現疾病的差異蛋白及其功能，其所在路徑及發生機制研究還限于推測或推理。因此，建議建立檢測過程量化標準，規范研究結果;擴大研究樣本量而減小差異性，探索共性規律;深化病證結合研究，從發現差異蛋白向揭示作用機制轉變;把基因組學、蛋白質組學和代謝組學有機結合，系統闡明中醫辨證論治規律。

與此同時，MetaCore、IPA、KEGG等這些與蛋白質組學相關的生物學信息數據庫、信息挖掘和分析平臺逐步發展起來。這些平臺支持，可以更加全面準確地整合人類疾病、藥物以及其他與健康相關的生物信息研究。

總之，隨著蛋白質組學技術的不斷成熟，對中醫證候研究將更加深入，從而推動從分子和細胞水平上認識中醫證候的機理，為疾病預防、診斷和治療提供更加有效的技術和方法。

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R54

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1006-3250(2016) 09-1277-04

2016-03-22

欒依含(1986-)，女，遼寧營口人，醫學博士，從事心血管疾病的中醫證候與治法研究。

△通訊作者:曹洪欣，教授，中國中醫科學院首席研究員，從事中醫藥防治心血管疾病與病毒性疾病的臨床與研究，E-mail:caohx898@163．com。