PTEN在類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞中的表達及意義*

吳云婷，　劉　巖，　劉　夢，　楊夢如，　莫碧瑤，　潘云峰

(中山大學附屬第三醫(yī)院風濕免疫科，廣東 廣州 510630)

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PTEN在類風濕關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞中的表達及意義*

吳云婷，劉巖，劉夢，楊夢如，莫碧瑤，潘云峰△

(中山大學附屬第三醫(yī)院風濕免疫科，廣東 廣州 510630)

[摘要]目的： 探討第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(PTEN)在人類風濕關節(jié)炎(RA)成纖維樣滑膜細胞(FLS)中的表達水平及意義。方法: 利用組織塊法獲得并體外培養(yǎng)人RA-FLS、骨關節(jié)炎(OA)-FLS及關節(jié)創(chuàng)傷-FLS；采用實時熒光定量PCR法檢測各組FLS中PTEN mRNA表達水平的差異；采用Western blotting法檢測各組FLS的PTEN蛋白表達水平以及Akt Thr308位點磷酸化水平的差異。結果: (1) RA-FLS中的PTEN mRNA表達水平顯著低于OA-FLS及關節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)，而OA-FLS與關節(jié)創(chuàng)傷-FLS之間的PTEN mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異。(2) RA-FLS的PTEN 蛋白表達水平顯著低于OA-FLS及關節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.05)，而OA-FLS與關節(jié)創(chuàng)傷-FLS之間的PTEN蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異。(3) RA-FLS中的Akt蛋白Thr308位點磷酸化水平顯著高于OA-FLS及關節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)，且OA-FLS中該位點的磷酸化水平顯著低于關節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)。(4)RA-FLS中的PTEN蛋白水平與Akt Thr308位點磷酸化水平呈顯著負相關(P<0.01)。結論: RA-FLS中PTEN基因呈低水平表達，可能與Akt Thr308位點磷酸化水平異常增高相關。

[關鍵詞]PTEN； Akt； 關節(jié)炎， 類風濕； 成纖維樣滑膜細胞

類風濕關節(jié)炎 (rheumatoid arthritis, RA)是一種病因未明的慢性全身性炎癥性疾病。RA主要累及關節(jié)滑膜，滑膜炎癥細胞浸潤以及襯里層增生是其典型病理表現(xiàn)。RA成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes, FLS)是滑膜襯里層中特殊的細胞群，它發(fā)生了類腫瘤樣改變，與RA滑膜的持續(xù)性的慢性炎癥、關節(jié)破壞和滑膜增生都有密切的關系[1]。而目前有關其生物學特性及變化機制尚未清楚。

第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)為一抑癌基因。PTEN蛋白具有雙特異磷酸酯酶活性，廣泛地參與調節(jié)細胞周期、抑制細胞增殖、抑制細胞遷移、維持染色體穩(wěn)定性等生命活動。PTEN對磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt)信號通路的負性調控作用在多種細胞得到證實[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，RA患者滑膜襯里層的PTEN mRNA低表達；相關動物實驗亦提示RA-FLS中PTEN mRNA低表達[3]。本文將比較RA-FLS與其它關節(jié)疾病FLS之間的PTEN表達和Akt Thr308位點磷酸化水平的差異，研究PTEN在RA-FLS中的異常表達狀態(tài)及其對PI3K/Akt通路的影響。

材料和方法

1標本采集

關節(jié)滑膜組織取自中山大學附屬第三醫(yī)院2014年3月至2015年9月期間行膝關節(jié)置換術或膝關節(jié)關節(jié)鏡手術的患者。RA患者4名，平均年齡48歲(33～58歲)，3名為女性；骨關節(jié)炎(osteoarthritis, OA)患者5名，平均年齡72.3歲(64～79歲)，均為女性；創(chuàng)傷患者4名，平均年齡29.7歲(18～45歲)，均為男性。所有RA患者均符合1987年美國風濕病學會類風濕關節(jié)炎分類標準；所有OA患者均符合1995年美國風濕病學會膝骨關節(jié)炎分類標準；所有創(chuàng)傷患者均排除了RA、OA及其它系統(tǒng)性結締組織病診斷。

2主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)及高糖DMEM無血清培養(yǎng)基購自Gibco；RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)和SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)均購自TaKaRa；蛋白提取用Lysis Buffer購自南京凱基生物科技有限公司；cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets和PhosStop Phosphatase Inhibitor Cocktail Tablets購自Roche；PTEN Rabbit mAb、Phospho-Akt(Thr308) Rabbit mAb和Akt (pan) Rabbit mAb均購自CST；兔抗GAPDH多克隆IgG抗體購自杭州賢至生物科技有限公司；HRP標記羊抗兔IgG抗體購自北京博奧森生物技術有限公司。

3主要方法

3.1FLS的培養(yǎng)與鑒定滑膜組織經10% PBS緩沖液清洗后，用眼科剪反復剪切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊。將組織塊移入培養(yǎng)瓶鋪置均勻，加入適量含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內直立4h后放倒培養(yǎng)。視細胞生長情況及培養(yǎng)液性狀每3～4d換液1次。當細胞生長到覆蓋瓶底約80%即可進行傳代培養(yǎng)，經多次傳代后可獲得純度較高的FLS。通過2種方法進行培養(yǎng)細胞的鑒定：于光學相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)以及通過流式細胞術檢測培養(yǎng)細胞的CD55陽性率。本實驗使用的是第3～5代FLS。

3.2實時熒光定量PCR法檢測PTEN mRNA的表達收集細胞，用RNAiso Plus裂解細胞，經過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經過沉淀、洗滌，最后溶于適量的RNase-free水中。用分光光度計進行RNA的純度分析，A260/A280在1.8～2.0的范圍內表示RNA純度較好。按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒說明書進行反轉錄，條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。依照SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR反應。引物序列見表1。反應體系體積20 μL，使用ABI 7500實時定量PCR儀，反應程序為：95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s,循環(huán)40次;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反應結束后分析各孔Ct值，并計算各樣本的2-ΔΔCt值。

3.3Western blotting法檢測PTEN蛋白表達以及Akt Thr308位點磷酸化水平提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，用Western blotting法檢測各組FLS的PTEN蛋白表達及Akt(Thr308)磷酸化水平。配制不連續(xù)SDS-聚丙烯酰胺凝膠，分離膠濃度為10%，各樣品取20 μg總蛋白進行凝膠電泳。經凝膠電泳分離蛋白質后，通過電轉印法將蛋白質從凝膠轉移至PVDF膜上。用5% BSA封閉PVDF膜上的非特異性蛋白結合位點，再用相應的Ⅰ抗稀釋液(稀釋比1∶1 000)4 ℃搖床孵育過夜。使用HRP標記的Ⅱ抗稀釋液(稀釋比1∶2 000)室溫孵育1～2 h后，浸泡ECL發(fā)光液并進行曝光。通過Image-Pro Plus軟件分析曝光圖像，讀取各條帶的積分吸光度(integral absorbance，IA)值，計算各樣本的目的蛋白與內參照GAPDH的IA比值進行目的蛋白的相對定量。

4統(tǒng)計學處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni法，P<0.05時認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結果

1FLS的鑒定

光學顯微鏡下觀察可見細胞呈細長紡錘形；胞核居中，卵圓形，邊界清楚，核仁明顯，與成纖維細胞相似，鑒定細胞形態(tài)與FLS相符，見圖1。流式細胞術檢測第3代細胞的CD55表達陽性率達92.8%，提示實驗用細胞的FLS純度較高，見圖2。

Figure 1.Morphology of the third generation of RA-FLS observed under optical microscope (×100).

圖1光鏡下第3代RA-FLS形態(tài)

Figure 2.CD55 expression in the third generation of RA-FLS detected by flow cytometry.

圖2流式細胞術檢測第3代RA-FLS表面CD55陽性率

2FLS的PTEN mRNA表達差異

用實時熒光定量PCR法檢測各組細胞內PTEN mRNA的表達，Ct值經GAPDH標準化后，以關節(jié)創(chuàng)傷-FLS為對照計算2-ΔΔCt值進行分析。RA-FLS的PTEN mRNA表達水平顯著低于OA-FLS及關節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)，而OA-FLS與關節(jié)創(chuàng)傷-FLS之間的PTEN mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異，見圖3。

3FLS的PTEN蛋白表達差異

用Western blotting法檢測各組細胞的PTEN蛋白表達水平，IA值經GAPDH標準化后分析得，RA-FLS的PTEN 蛋白表達水平顯著低于OA-FLS及關節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.05)，而OA-FLS與關節(jié)創(chuàng)傷-FLS之間的PTEN蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異，見圖4。

Figure 3.PTEN mRNA expression in FLS. Compared with other groups, the expression of PTEN mRNA was significantly decreased in RA-FLS. Mean±SD.n=3～4.**P<0.01vsRA-FLS.

圖3各組FLS的PTEN mRNA表達水平

Figure 4.PTEN protein expression in FLS. Compared with other groups, the expression of PTEN was significantly decreased in RA-FLS. Mean±SD.n=4.*P<0.05vsRA-FLS.

圖4各組FLS的PTEN 蛋白表達水平

4FLS的Akt(Thr308)磷酸化程度差異

用Western blotting法檢測各組細胞的p-Akt(Thr308)蛋白及Akt總蛋白表達水平，Akt總蛋白IA值經GAPDH標準化，以p-Akt(Thr308)蛋白與Akt總蛋白的IA比值表示Akt蛋白Thr308位點的磷酸化水平。分析得，RA-FLS、OA-FLS及關節(jié)創(chuàng)傷-FLS之間的Akt總蛋白表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；RA-FLS的Akt蛋白Thr308位點的磷酸化水平顯著高于OA-FLS及關節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)，且OA-FLS該位點的磷酸化水平顯著低于關節(jié)創(chuàng)傷-FLS(P<0.01)，見圖5。

5RA-FLS中的PTEN蛋白水平與Akt(Thr308)磷酸化水平的聯(lián)系

對RA-FLS中的PTEN蛋白水平與Akt(Thr308)磷酸化水平進行關聯(lián)性分析，我們發(fā)現(xiàn)兩者之間呈顯著負相關，Pearson積矩相關系數(shù)為-0.994 5(P<0.01)，見圖6。

討論

RA的基本病理改變?yōu)榛ぱ?。RA-FLS在RA的發(fā)病機制中起關鍵作用，具有一定的類腫瘤性，表現(xiàn)在以下幾個方面：(1)增殖能力增強，凋亡減少。在體外培養(yǎng)細胞及人源化RA動物模型的研究中發(fā)現(xiàn)，RA-FLS 在體外或脫離體內免疫系統(tǒng)環(huán)境的情況下仍具有增殖的特性[1]。(2)遷移侵襲能力增強。

Figure 5.Phosphorylation level of Akt(Thr308) in FLS. Compared with other groups, the phosphorylation level of Akt(Thr308) was significantly increased in RA-FLS, while the phosphorylation level of Akt(Thr308) in OA-FLS was the lowest. Mean±SD.n=4.**P<0.01vsRA-FLS;##P<0.01vstrauma-FLS.

圖5各組FLS的Akt(Thr308)磷酸化水平

Figure 6.Pearson correlation between the phosphorylation level of Akt(Thr308) and PTEN protein expression in RA-FLS, showing a significant negative correlation.

圖6RA-FLS中Akt Thr308位點磷酸化水平與PTEN蛋白水平的關聯(lián)性分析

在沒有外來刺激的情況下，人源化RA動物模型中的RA-FLS能夠通過外周血液循環(huán)遷移至遠處的關節(jié)軟骨，并對軟骨發(fā)生侵襲作用，且這種遷移和侵襲作用不能被TNF-α拮抗劑所抑制，提示RA-FLS可在關節(jié)腔內遷移、侵襲同時，還可跨內皮的長距離遷移和侵襲[4]。(3)分泌功能紊亂。RA-FLS通過分泌蛋白酶、細胞因子、小分子炎癥介質等成分，產生促侵蝕、趨化炎性細胞、促炎等作用[1]。

在本研究中設有2個對照組，分別為OA-FLS以及關節(jié)創(chuàng)傷-FLS。OA是一種常見于老年人的關節(jié)退行性疾病，其主要特征為關節(jié)軟骨的侵蝕、邊緣骨增生，軟骨下硬化等改變，在滑膜組織中，也存在低水平的滑膜炎癥。與RA相比，OA滑膜炎較弱且較局限[5]。另一對照的理想來源為健康人的滑膜組織，但因取材困難，最終選擇半月板損傷等輕型關節(jié)創(chuàng)傷患者的滑膜組織培養(yǎng)得FLS。

PTEN是人類10號染色體上的一個抑癌基因[6]，其編碼的PTEN蛋白主要分布于胞質中，蛋白氨基端(N端)是其主要結構功能區(qū)，含有使PTEN蛋白具有腫瘤抑制活性的磷酸酶殘基序列及與細胞張力蛋白(tensin)、輔組蛋白(auxilin)同源的序列，是PTEN蛋白發(fā)揮蛋白磷酸酶活性和脂質磷酸酶活性所必需的。PTEN可通過去磷酸化方式參與細胞調控，且主要通過脂質磷酸酶活性完成，這在已知的抑癌基因中十分少見。目前已知PTEN抑制細胞生長、促進細胞凋亡的作用主要通過3條途徑完成：(1)通過對3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate, PIP3)去磷酸化抑制PI3K/Akt通路；(2)通過對灶性黏連激酶(focal adhesion kinase, FAK)去磷酸化下調p130Crk聯(lián)系底物(p130Crk-associated substrate, p130Cas)，抑制細胞浸潤、轉移，同時FAK去磷酸化還可抑制PI3K活性從而抑制PI3K/Akt通路；(3)選擇性抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)通路中的細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)。其中研究得最多的是其對PI3K/Akt通路的抑制作用[7]。在正常組織和細胞當中，PTEN基因及蛋白表達水平較高，半衰期較長。然而在某些疾病尤其在腫瘤中，PTEN基因會出現(xiàn)不同程度的缺失和突變，PTEN蛋白也相應出現(xiàn)下調和異常[8]。有報道稱，對RA患者滑膜組織的免疫組化實驗未檢測到襯里層(FLS聚集區(qū))的PTENmRNA表達，而襯里下層的表達水平較高；通過將RA患者的滑膜細胞及人類軟骨移植入SCID小鼠構建人源化動物模型發(fā)現(xiàn)，侵蝕軟骨的RA滑膜細胞幾乎檢測不到PTEN mRNA的表達,提示PTEN的低表達與RA FLS的侵襲能力有一定的聯(lián)系[3]。

Akt為絲/蘇氨酸蛋白激酶，其中央激酶結構域中的308位點含Akt部分活化所必需的蘇氨酸，羧基末端的調節(jié)區(qū)中的473位點包含Akt完全活化所必需的絲氨酸[9]。目前認為Akt蛋白激酶的完全激活需要其自身這2個磷酸化位點的磷酸化。經磷酸化激活后的Akt可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游一系列靶蛋白，經多種途徑促進細胞存活，是重要的抗凋亡調節(jié)因子[10]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，MK-2206(可抑制Akt的Thr308位點和Ser473位點的自身磷酸化作用)抑制Akt磷酸化可明顯抑制RA-FLS細胞活性，且該抑制作用呈時間和劑量依賴性，提示Akt的磷酸化參與了RA-FLS增殖及活化。另有多項研究發(fā)現(xiàn)Akt的異常激活還參與了RA的軟骨破壞、免疫異常等活動，在RA的致病機制中發(fā)揮了重要作用。

與腫瘤細胞類似，RA-FLS內存在多條信號通路的異常，課題組前期研究就發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物2(mTOCR2)/Akt通路在RA-FLS中存在異?；罨痆11]。而Akt上游的另一通路， PI3K/Akt通路，是細胞內重要信號轉導通路之一，廣泛存在于細胞中，參與細胞增殖、凋亡及分化等功能的調控作用，在多種腫瘤細胞中激活。PI3K被激活后，可催化4,5-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-biphosphate, PIP2)生成PIP3，PIP3將Akt和磷酸肌醇依賴性蛋白激酶1(phosphoinositide-dependent kinase 1, PDK-1)募集到細胞膜，在PDK1的輔助下，使Akt Thr308位點磷酸化，同時，在mTORC2、磷酸肌醇依賴性蛋白激酶2(phosphoinositide-dependent kinase 2, PDK-2)或整合素連接的激酶(integrin- linked kinase，ILK)等作用下，Ser473位點也發(fā)生磷酸化后，Akt成為有活性的激酶[12-13]。PTEN蛋白具有脂質磷酸酶活性，可使其底物PIP3去磷酸化而失活，與PI3K作用相反，從而抑制Akt Thr308位點的磷酸化，抑制了PI3K活化信號向Akt傳導，對PI3K/Akt信號通路起著負調控作用[2]?？梢夾kt和PTEN分別是PI3K/Akt信號通路中的效應因子和負性調節(jié)因子。

本課題使用的是體外培養(yǎng)的FLS細胞，細胞純度較高，細胞類型更有針對性；另外，相關實驗結果也可在一定程度上反映某些分子水平的異常是否會因為細胞脫離體內炎癥環(huán)境以及細胞傳代而發(fā)生改變。通過Western blotting及熒光定量PCR，我們發(fā)現(xiàn)無論是在mRNA水平還是蛋白水平，RA-FLS中的PTEN均呈低表達，與相關研究結果一致。結合滑膜組織的PTEN mRNA免疫組化結果及相關動物實驗結果，說明RA-FLS中PTEN的低表達是持續(xù)存在的。為了探索PTEN在RA-FLS中是否影響PI3K/Akt通路，在前期發(fā)現(xiàn)RA-FLS存在Akt Ser473位點磷酸化水平增高的基礎上，我們通過Western blotting研究Akt(Thr308)位點的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)RA-FLS中Akt(Thr308)位點的磷酸化水平同樣存在異常增高，且Akt(Thr308)位點的磷酸化水平與PTEN蛋白水平呈負相關，提示RA-FLS中PI3K/Akt通路激活可能與PTEN低表達相關。有趣的是，OA-FLS與關節(jié)創(chuàng)傷-FLS的PTEN表達水平無顯著差別，但OA-FLS的Akt(Thr308)磷酸化水平顯著低于關節(jié)創(chuàng)傷-FLS?？赡艿脑蛴校篜I3K/Akt通路有多種調控分子，在OA-FLS中，可能還有其它分子參與了Akt(Thr308)磷酸化過程的調節(jié)；而創(chuàng)傷關節(jié)內亦存在一定炎癥反應，可能會促進Akt的活化；另外，關節(jié)創(chuàng)傷組患者年齡明顯低于OA組患者，發(fā)生創(chuàng)傷后組織的自我修復能力較強，在細胞增殖等修復過程中可能存在PI3K/Akt通路的激活。

PTEN的調控細胞周期、抑制細胞凋亡、抑制細胞遷移侵襲等功能已被普遍認識，尤其是在腫瘤領域。本研究證明了RA-FLS中的PTEN呈低表達，且可能造成下游Akt(Thr308)磷酸化水平上升?？紤]到PTEN及p-Akt的作用，我們有理由推測PTEN的低表達可致RA-FLS類腫瘤化，而增加PTEN表達可逆轉該過程。這一設想已在動物模型中得到驗證：將表達人PTEN基因的腺病毒載體注入CIA大鼠的關節(jié)腔內，可引起大鼠RA FLS中的Akt磷酸化水平下降，血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)產生減少，且FLS凋亡增加[14]。由此，增加局部PTEN表達可為干預RA進展提供新思路。

總之，本研究證明PTEN在RA-FLS中呈持續(xù)性低水平表達，在細胞脫離體內炎癥環(huán)境以及細胞傳代后依然存在，而這可能與Akt Thr308位點磷酸化水平異常增高相關。至于PTEN在RA-FLS持續(xù)低表達的原因，仍值得進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Expression and function of PTEN in fibroblast-like synoviocytes of rheumatoid arthritis

WU Yun-ting, LIU Yan, LIU Meng, YANG Meng-ru, MO Bi-yao, PAN Yun-feng

(DepartmentofRheumatology,TheThirdAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510630,China.E-mail:panyunfeng@medmail.com.cn)

[KEY WORDS]PTEN; Akt; Arthritis, rheumatoid; Fibroblast-like synoviocytes

[ABSTRACT]AIM: investigate the expression ofPTENgene in fibroblast-like synoviocytes (FLS) of rheumatoid arthritis (RA).METHODS: FLS were isolated from synovial tissue obtained from the patients with RA, osteoarthritis (OA) or joint trauma. The mRNA expression of PTEN was detected by RT-qPCR. The protein levels of PTEN, p-Akt (Thr308) and total Akt were determined by Western blotting. The phosphorylation status of Akt was analyzed by the protein ratio of p-Akt (Thr308)/total Akt.RESULTS: The mRNA expression of PTEN was significantly lower in RA-FLS than that in OA-FLS and joint trauma-FLS (P<0.01), while no statistically significant difference was observed between that in OA-FLS and joint trauma-FLS (P<0.05). Similarly, the protein expression of PTEN in the RA-FLS was much lower than that in the OA-FLS and joint trauma-FLS (P<0.05), and there was no difference between the latter 2 groups. Moreover, the phosphorylation level of Akt (Thr308) in the RA-FLS was significantly higher than that in the other 2 control groups (P<0.01), and that in OA-FLS was much lower than that in the joint trauma-FLS (P<0.01). Finally, Pearson correlation analysis between the phosphorylation level of Akt (Thr308) and PTEN protein expression in the RA-FLSs showed a significant negative correlation (r=-0.994 5,P<0.01).CONCLUSION: The mRNA and protein expression of PTEN are both decreased in the RA-FLS, which may contribute to the increased phosphorylation level of Akt (Thr308).

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 0978- 06

[收稿日期]2015- 12- 21[修回日期] 2016- 04- 05

*[基金項目]廣東省自然科學基金資助項目(No. 2014A030313080)

通訊作者△Tel: 020-82179589; E-mail： panyunfeng@medmail.com.cn

[中圖分類號]R593.22; R363

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.003