IGF-Ⅱ在肝癌Huh7細胞增殖、遷移與侵襲中的作用*

陳　磊,　 陳埏芳,　高　飛,　黃　衛△

(1廣州市中西醫結合醫院內二科, 廣東 廣州 510800；2暨南大學附屬第一醫院消化內科， 廣東 廣州 510632)

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IGF-Ⅱ在肝癌Huh7細胞增殖、遷移與侵襲中的作用*

陳磊1, 陳埏芳2,高飛2,黃衛2△

(1廣州市中西醫結合醫院內二科, 廣東 廣州 510800；2暨南大學附屬第一醫院消化內科， 廣東 廣州 510632)

[摘要]目的： 以胰島素樣生長因子Ⅱ(IGF-Ⅱ)為靶點，觀察不同表達水平的IGF-Ⅱ對肝癌Huh7細胞生長增殖、侵襲和遷移的影響，探討IGF-Ⅱ基因在肝癌發生發展過程中的作用，為肝癌的靶向治療提供新的思路。方法: 分別將構建好的IGF-Ⅱ基因過表達質粒pcDNA3.1(+)-IGF-Ⅱ和RNA干擾質粒pLVX-shRNA2-IGF-Ⅱ轉染肝癌Huh7細胞，通過real-time PCR及Western blot檢測IGF-Ⅱ的表達，采用CCK-8、平板克隆形成、細胞劃痕、Transwell小室實驗，檢測過表達與抑制IGF-Ⅱ對肝癌Huh7細胞生長增殖、侵襲與遷移的影響。結果: 過表達IGF-Ⅱ能促進肝癌細胞的生長增殖及侵襲遷移 (P<0.05)，而抑制IGF-Ⅱ的表達得到相反的結果。結論: IGF-Ⅱ參與調控肝癌Huh7細胞的生物學行為，可能在肝細胞癌的發生發展中發揮重要作用。

[關鍵詞]胰島素樣生長因子Ⅱ； 肝細胞癌

原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是對人類構成嚴重威脅的疾病之一，其全球發病率逐年增長，在腫瘤相關死亡中位居第3位[1]。胰島素樣生長因子Ⅱ(insulin-like growth factor Ⅱ,IGF-Ⅱ)，是一種促胚胎生長因子，現有的研究表明，IGF-Ⅱ在肝癌及癌旁組織中異常過量表達，并與分化程度呈負相關，即分化程度越低IGF-Ⅱ的表達量越高，在肝細胞再生結節、不典型增生、肝纖維化等癌前病變中表達量更高，提示IGF-Ⅱ與肝癌的發生發展密切相關，特別是在肝細胞癌變的早期階段發揮著重要作用[2-3]，本課題組擬利用前期靶向IGF-Ⅱ基因構建的過表達質粒及RNA干擾質粒，通過脂質體轉染肝癌Huh7細胞，在細胞水平上觀察IGF-Ⅱ對肝癌Huh7細胞生長、增殖、侵襲、遷移等生物學行為的影響，為尋找肝癌基因治療的新靶點和新方法奠定基礎。

材料和方法

1細胞系

人肝癌細胞株Huh7由廣州萊德爾生物科技有限公司提供，常規培養于含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中，培養條件為37 ℃、5%CO2的濕潤無菌環境中。

2主要試劑與儀器

pLVX-shRNA2-IGF-Ⅱ和pcDNA3.1(+)-IGF-Ⅱ由前期實驗合成，測序結果與已知序列進行BLAST完全一致；胎牛血清和DMEM培養基(HyClone)；Lipofectamine2000轉染試劑(Invitrogen)；SYBRGreenPCRMasterMix(TOYOBO)；BCA法蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基生物發展有限公司)；CCK-8溶液(Beyotime)。定量PCR儀(ABIPRISM?7500SequenceDetectionSystem)；電泳儀(北京百晶生物科技有限公司BG-Power600i);酶標儀(Thermo)。

3方法

3.1實驗分組與細胞轉染根據IGF-Ⅱ在肝癌細胞中的表達，分5個組：blank組細胞不進行轉染;IGF-Ⅱ對照組轉染pcDNA3.1(+)質粒;IGF-Ⅱ組轉染pcDNA3.1(+)-IGF-Ⅱ重組質粒;siIGF-Ⅱ組轉染pLVX-shRNA2-IGF-Ⅱ重組質粒的細胞;siIGF-Ⅱ對照組轉染陰性質粒。轉染前1d，取對數生長期的Huh7細胞，接種于不同試驗需要的培養板中，常規培養至細胞匯合度達80%左右，根據說明書采用Lipofectamine2000 進行轉染。

3.2IGF-Ⅱ 表達的real-timePCR檢測細胞轉染后，按照TRIzol說明書抽提細胞總RNA，進行總RNA純度和完整性檢測后，在PCR儀上完成逆轉錄得到產物cDNA，并以此為模板，采用SYBRGreenPCRMasterMix進行PCR擴增，IGF-Ⅱ的PCR上游引物序列為5’-CTGGAGACGTACTGTGCTA-3’, 下游引物序列為5’-GACTGCTTCCAGGTGTCAT-3’;內參照18S的PCR上游引物序列為5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’，下游引物序列為5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。PCR反應條件為95 ℃ 30s；95 ℃ 5s，60 ℃ 30s，72 ℃ 30s，共40個循環，反應結束后確認real-timePCR的擴增曲線和熔解曲線，每個樣品重復3次。IGF-II的mRNA相對表達量用2-ΔΔCt的平均值±標準差表示。

3.3IGF-Ⅱ表達的Westernblot檢測細胞轉染后，按照蛋白提取試劑盒抽提細胞總蛋白，使用BCA法蛋白檢測試劑盒進行總蛋白定量。再進行SDS-PAGE，選擇恒壓電泳：80V恒壓電泳30min，肉眼見到溴酚藍指示劑跑到分離膠水平后，改成100V恒壓電泳直到溴酚藍剛跑出膠底部便可終止，將凝膠電泳結果轉膜至PVDF膜上；孵育Ⅰ抗、Ⅱ抗進行免疫印記。

3.4IGF-Ⅱ表達對肝癌Huh7細胞生長增殖能力的影響采用CCK-8法進行檢測，按照每1×104個的接種量將細胞接種于96孔細胞培養板中，每組細胞設3個復孔，同時設調零孔，每孔體積200μL；將培養板置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中孵育過夜；收集各個時點的細胞(0、24、48、72h)，在避光條件下每孔加入10μLCCK-8溶液，于37 ℃繼續孵育4h；酶標儀在450nm波長處測定吸光值即A值；根據同一樣品的“增殖率(%)=待測時點A值平均值÷0hA值平均值×100%”公式，并以增殖率為縱坐標、時間為橫坐標繪制細胞增殖曲線。

3.5IGF-Ⅱ表達對肝癌Huh7細胞克隆形成能力的影響采用平板克隆形成實驗進行檢測，分別按照每孔50、100和200個細胞的接種量將細胞接種于96孔細胞培養板中，各設3個復孔，每組總共接種9個孔；將培養板置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養；每天察看，當有細胞克隆形成時即可吸掉各孔的培養基終止培養，PBS緩沖液漂洗2次，每孔加入100μL的甲醇溶液室溫下固定15min，然后棄去固定液；每孔加入200μL蘇木素染色液充分覆蓋皿底染色20min后，自來水沖洗后晾干，計算集落數；使用酶聯斑點圖像自動分析儀分析、掃描拍照；根據“克隆形成率(%)=克隆數÷接種細胞數×100%”的公式，計算克隆形成率。

3.6IGF-Ⅱ對肝癌Huh7細胞遷移能力的影響采用細胞劃痕實驗進行檢測，將處于對數生長期的肝癌Huh7細胞接種6孔培養板上，置于37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養；待細胞融合率達80%時，使用10μL無菌微量移液槍頭在細胞板上劃橫線，盡量用力均勻一致、不要傾斜；用無菌的PBS液沿培養皿的側壁輕輕地沖洗細胞3次，洗去劃下的細胞； 加入不含血清的培養基置于37 ℃孵箱中進行孵育，分別于劃痕后0、6、24和48h取樣，拍照；Image-ProPlus6.0軟件測量各組細胞相同時點任意8個部位劃痕寬度，計算細胞遷移率[(0h距離-其它時點距離)/0h距離],以反映各組肝癌細胞運動遷移能力。

3.7IGF-Ⅱ對肝癌Huh7細胞侵襲能力的影響采用Transwell小室實驗進行檢測，將上室放入下室(24孔板)中，每個上室中加入2滴無血清培養基使膜浸潤，放入培養箱中，棄去上室中浸膜用的培養基，每個上室中加入200μL的單細胞懸液(即每室1×105個細胞)，每個下室中加入600μL完全培養基，每組細胞做6個小室，共30個小室；在培養箱中孵育30h后，取出小室，用棉簽拭去上室的細胞，PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定5min，蘇木素溶液染色10min；切去小室膜，置于載玻片上，滴少許二甲苯覆蓋，再滴樹膠上蓋蓋玻片；計數，倒置顯微鏡下計數移至微孔膜下層的細胞。

4統計學處理

計量資料以均數±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS15.0軟件處理各組數據，多個樣本均數間比較進行方差齊性檢驗，再做單因素方差分析(one-wayANOVA)，然后兩樣本均數的比較采用t檢驗，方差不齊時采用t’檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1IGF-ⅡmRNA在各組肝癌Huh7細胞中的表達

采用實時熒光定量PCR對不同試驗組中IGF-ⅡmRNA的相對表達量進行檢測，結果發現，IGF-Ⅱ質粒轉染組IGF-ⅡmRNA表達顯著高于IGF-Ⅱ對照組(P<0.05)；而siIGF-Ⅱ組IGF-ⅡmRNA的表達顯著低于siIGF-Ⅱ對照組(P<0.05),blank組與IGF-Ⅱ對照組、siIGF-Ⅱ對照組無明顯差異。此結果說明，過表達質粒在細胞中成功轉錄，在siIGF-Ⅱ組IGF-Ⅱ基因的轉錄也被成功抑制，見圖1。

2IGF-Ⅱ蛋白在各組肝癌Huh7細胞中的表達

用DAB顯色法，分別對5組蛋白樣品中IGF-Ⅱ蛋白及內參照GAPDH進行檢測，結果顯示各組中GAPDH表達量基本一致，然而IGF-Ⅱ在5組的表達量存在較大差異。在IGF-Ⅱ組的IGF-Ⅱ表達量顯著高于blank組，siRNA組中的表達量顯著低于blank組，而IGF-Ⅱ對照組、siIGF-Ⅱ對照組與blank組比較，IGF-Ⅱ蛋白表達水平沒有顯著差異，見圖2。

Figure1.RelativeexpressionofIGF-IImRNAinHuh7cells.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vsIGF-IIgroup;#P<0.05 vssiIGF-IIgroup.

圖1肝癌Huh7細胞IGF-II mRNA的相對表達量

Figure 2.IGF - II protein expression level in Huh7 cells.

圖2肝癌Huh7細胞IGF-II 蛋白水平的表達量

3IGF-Ⅱ表達對肝癌Huh7細胞生長能力的影響

采用CCK-8法檢測Huh7細胞生長速度的改變，結果顯示，從第1天開始，IGF-Ⅱ組細胞A值就顯著高于blank組及IGF-Ⅱ對照組(P<0.05)，而IGF-Ⅱ對照組與blank組無明顯差異；從第2天開始，siIGF-Ⅱ組細胞A值顯著低于blank組及siIGF-Ⅱ對照組(P<0.05)，siIGF-Ⅱ對照組A值與blank組無明顯差異，見表1。

*P<0.05vsIGF-Ⅱgroup;▲P<0.05vssiIGF-Ⅱ group.

4IGF-Ⅱ表達對肝癌Huh7細胞增殖能力的影響

采用平板克隆實驗，結果顯示，IGF-Ⅱ組細胞克隆形成率顯著高于blank組及IGF-Ⅱ對照組(P<0.05)，而IGF-Ⅱ對照組與blank組無明顯差異；siIGF-Ⅱ組細胞克隆形成率顯著低于blank組及siIGF-Ⅱ對照組，而siIGF-Ⅱ對照組與blank組無明顯差異，見圖3、4。

Figure 3.Colony formation experiment of Huh7 cells.

圖3肝癌Huh7細胞平板克隆形成實驗

5IGF-Ⅱ表達對肝癌Huh7細胞遷移能力的影響

采用細胞劃痕實驗檢測，結果發現劃痕6 h后，與blank組和IGF-Ⅱ對照組相比，IGF-Ⅱ組的遷移能力顯著增強(P<0.05)，48 h后劃痕已經基本被遷移過來的細胞所覆蓋；siIGF-Ⅱ組的Huh7細胞遷移能力則明顯下降(P<0.05),見圖5、表2。

Figure 4.Colony formation efficiency of Huh7 cells.Mean±SD.n=9.*P<0.05vsIGF-II group;#P<0.05vssiIGF-II group.

圖4肝癌Huh7細胞平板克隆率

6IGF-Ⅱ表達對肝癌Huh7細胞侵襲能力的影響

采用Transwell小室實驗檢測，結果發現IGF-Ⅱ組的Huh7細胞，穿膜細胞數量顯著高于blank組及IGF-Ⅱ對照組(P<0.05)，而IGF-Ⅱ對照組與blank組之間差異無統計學意義。siRNA組的Huh7細胞相對于blank組及siIGF-Ⅱ對照組，穿膜細胞數量顯著降低 (P<0.05)，而siIGF-Ⅱ對照組與blank組之間差異無統計學意義，見圖6、7。

Figure 5.Scratch experiment images of Huh7 cells.

圖5肝癌Huh7細胞劃痕實驗

*P<0.05vsIGF-Ⅱ;▲P<0.05vsblank.

Figure 6.The representative result of Transwell experiment of Huh7 cells.

圖6肝癌Huh7細胞Transwell實驗

Figure 7.Transwell experiment results in Huh7 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsIGF-II group;#P<0.05vssiIGF-II group.

圖7肝癌Huh7穿膜細胞數

討論

HCC是世界范圍內死亡率最高的惡性腫瘤之一，我國屬于高發地區，在腫瘤相關死亡原因中占第3位[1]，其發病率及死亡率逐年遞增，其起病隱匿且早期極易發生轉移，因此有效抑制肝癌細胞的侵襲轉移是治療肝癌的關鍵。

在肝癌的發生早期，IGF-Ⅱ在肝癌組織中已有過量表達，高于癌旁組織及遠癌組織，并與分化程度呈負相關，即分化程度越低IGF-Ⅱ的表達量越高，而且在肝細胞再生結節及肝細胞不典型增生這些肝癌前病變中表達量更高，在肝炎、肝硬化到肝細胞癌的整個演變過程中，IGF-Ⅱ mRNA的異常表達也表現出逐漸遞增的趨勢，這些研究結果提示IGF-Ⅱ與肝癌的發生發展密切相關，尤其在肝癌的初期階段發揮著重要作用[2-3]。

1IGF-Ⅱ表達與肝癌細胞生長、增殖的關系

IGF-Ⅱ作為一種非常強的絲裂原，可以促進多種細胞的增殖調控因子，我們采用CCK-8法和平板克隆實驗觀察IGF-Ⅱ表達與肝癌的生長和增殖的關系，結果顯示：高表達IGF-Ⅱ對肝癌Huh7細胞的生長增殖有促進作用，下調IGF-Ⅱ表達可抑制肝癌的生長。其它抑制IGF-Ⅱ表達方法也有相似效果，如Zhang等[4]利用以IGF-Ⅱ基因P3啟動子為靶點合成的脫氧核酶轉染肝癌SMMC-7721細胞成功下調IGF-Ⅱ基因，MTT法繪制生長曲線發現與對照組相比生長能力被明顯抑制。Yao等[5]通過構建靶向IGF-Ⅱ的miRNA轉染肝癌HepG2細胞下調IGF-Ⅱ基因，發現細胞的克隆形成能力下降。目前認為其可能的機制是肝癌細胞通過分泌大量的IGF-Ⅱ，直接作用于自身或通過細胞間隙作用于周圍肝細胞膜上的IGF-ⅠR和/或IGF-ⅡR，促發分子間及信號通路的級聯反應，形成一個自我促進增殖的自分泌及旁分泌系統，以促進肝癌細胞的增殖[6-8]。阻斷IGF-Ⅱ表達抑制肝癌細胞則有可能成為肝癌基因治療的手段之一。

2IGF-Ⅱ表達與肝癌細胞遷移、侵襲的關系

目前已有臨床觀察發現IGF-Ⅱ與肝癌的轉移能力密切相關，如Qian等[9]利用PCR法檢測38例伴肝外轉移的肝癌患者,其循環中IGF-ⅡmRNA陽性率達100%，遠高于不伴肝外轉移者11.1%的陽性率；Xiong等[10]利用酶聯免疫法檢測肝癌患者血清中IGF-Ⅱ含量，發現IGF-Ⅱ的水平與化療后肝癌的轉移情況呈正相關。相關研究表明[11-12]，在體內外實驗中miR-625可通過抑制IGF-II mRNA結合蛋白1(IGF-ⅡBP1)阻止肝癌細胞的遷移和侵襲。我們在細胞水平利用劃痕實驗和Transwell小室實驗進行檢測，結果發現IGF-Ⅱ的表達對肝癌Huh7細胞的侵襲遷移有促進作用，下調IGF-Ⅱ表達能夠削弱肝癌的侵襲遷移能力，其機制尚未清楚，有研究表明[13],肝癌細胞遷移、侵襲與上皮間充質轉化相關，我們將行進一步研究來驗證IGF-Ⅱ是否涉及其中。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Role of IGF-Ⅱ in proliferation and migration of hepatocellular carcinoma Huh7 cells

CHEN Lei1, CHEN Shan-fang2, GAO Fei2, HUANG Wei2

(1SecondDepartmentofInternalMedicine,GuangzhouCityHospitalofIntegratedTraditionalChineseandWesternMedicine,Guangzhou510800,China;2DepartmentofGastroenterology,TheFirstAffiliatedHospitalofJinanUniversity,Guangzhou510632,China.E-mail:thuangw@163.com)

[KEY WORDS]Insulin-like growth factor Ⅱ; Hepatocellular carcinoma

[ABSTRACT]AIM: To observe the effects of insulin-like growth factorⅡ (IGF-Ⅱ) at different expression levels on hepatocellular carcinoma Huh7 cell proliferation and migration, and to explore the role of IGF-Ⅱ in the development of HCC. METHODS: The Huh7 cells were transfected with the over-expression plasmid pcDNA3.1(+)- IGF-Ⅱ or RNA interference plasmid pLVX-shRNA-IGF-Ⅱ by Lipofectamine 2000. The quantitative real-time PCR and Western blotting were used to verify the expression of IGF-II. The biological behaviors of the Huh7 cells were analyzed by CCK-8 assay, plate clone formation assay, cell scratch test and Transwell chamber experiment.RESULTS: Over-expression of IGF-II promoted the growth and migration of hepatocellular carcinoma cells (P<0.05), and the cell proliferation was significantly inhibited in the Huh7 cells with low IGF-II expression (P<0.05).CONCLUSION: IGF-II is involved in the regulation of biological behavior of hepatocellular carcinoma Huh7 cellsinvitro, which may play a promoting role in the development of hepatocellular carcinoma．

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1011- 06

[收稿日期]2015- 11- 10[修回日期] 2016- 04- 15

*[基金項目]廣東省科技計劃(No. 2010B080701063)

通訊作者△Tel: 020-38688931; E-mail: thuangw@163.com

[中圖分類號]R730.23

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.008