丁苯酞對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化及主動脈壁VCAM-1表達的影響

郜　娜，　楊慶宇,　劉秀梅

(1鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院藥學部，2鄭州人民醫院藥學部， 河南 鄭州 450000)

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丁苯酞對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化及主動脈壁VCAM-1表達的影響

郜娜1△，楊慶宇2,劉秀梅2

(1鄭州大學附屬腫瘤醫院/河南省腫瘤醫院藥學部，2鄭州人民醫院藥學部， 河南 鄭州 450000)

[摘要]目的： 觀察丁苯酞對ApoE-/-小鼠主動脈粥樣斑塊形成及血管細胞黏附分子(VCAM)-1表達影響，以探討其抗動脈粥樣硬化的可能機制，為其臨床應用提供理論依據和指導意義。方法: 90只6周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為3組，高脂飼喂建立動脈粥樣硬化模型，同時灌胃給予丁苯酞100及200 mg·kg-1·d-1進行干預，模型組給予等量生理鹽水灌胃。30只同齡雄性野生型C57BL/6J小鼠給予普通飼料喂養作為正常對照組。各組在18周齡及30周齡時分別處死15只動物。實驗過程中記錄各組小鼠體重變化及進食進水量。采用全自動生化儀檢測18周齡及30周齡各組小鼠血脂水平；ELISA法檢測血清ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量；取主動脈根部石蠟包埋切片行HE染色進行病理學檢查，計算斑塊相對面積；取胸主動脈進行real-time PCR檢測VCAM-1的mRNA含量，同時用Western blot法檢測VCAM-1的蛋白水平。結果: 與對照組相比，模型組小鼠18周齡及30周齡時體重、血脂及炎癥因子均顯著升高，且均發生動脈粥樣硬化斑塊，且VCAM-1的mRNA及蛋白表達顯著增加；丁苯酞對模型小鼠體重及進食進水量無影響；但丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1劑量組血脂水平顯著降低；血清ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量亦顯著減少；主動脈根部粥樣斑塊面積顯著減小；胸主動脈VCAM-1 的mRNA水平及蛋白表達均顯著下調。結論: 丁苯酞可延緩高脂飲食誘導的ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的發生，其機制與其同時降低血脂及抑制炎癥的發生，進而降低主動脈VCAM-1有關。

[關鍵詞]丁苯酞；ApoE-/-小鼠； 動脈粥樣硬化； 血管細胞黏附分子-1

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是嚴重威脅人類健康的慢性炎性疾病之一，諸多細胞及分子通路介導血管炎癥因子的產生[1]。經研究顯示，在AS發生機制中血管內皮細胞過度表達血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhension molecular-1，VCAM-1)是其主要危險因素[2-3]。在相關臨床報道中，發現在不穩定型心絞痛、急性心肌梗死以及腦中風病人血清中游離VCAM-1明顯高于對照組，并隨著病情的緩解而逐漸下降。因此，VCAM-1作為內皮功能障礙的標志，與C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)及TNF-α等炎癥因子也具有緊密聯系，可共同預測心血管事件的發生[4-6]。藥物干預降低血管內皮細胞過度表達成為近幾年預防及治療心腦血管疾病熱點。丁苯酞(butylphthalide，BP)最初是由芹菜籽中提取，后經實驗室合成，并于2002年被CFDA批準用于臨床中風患者的治療，其可通過減少氧化應激、改善線粒體功能、抑制血栓素A2的合成及阻止炎癥的發生等機制，達到解除微血管痙攣、抑制血小板聚集、保護腦細胞等作用[7]。此外，動物實驗證明丁苯酞可減少動物腦細胞淀粉樣變，繼而減少阿爾茲海默癥的發生。但丁苯酞對于動脈粥樣硬化病理發展以及內皮細胞中VCAM-1表達的影響報道甚少。本實驗通過高脂飲食誘導載脂蛋白E基因敲除(apolipoprotein E-knockout，ApoE-/-)小鼠建立AS模型，給予丁苯酞進行干預，觀察主動脈中VCAM-1的mRNA及蛋白表達變化，探討丁苯酞抗AS的作用機制。

材料和方法

1實驗動物、試劑和儀器

90只6周齡雄性ApoE-/-小鼠(品系C57BL/6J)，30只同齡雄性C57BL/6J野生型小鼠，均購自北京大學實驗動物中心，合格證編號為SCXK(京)2011-0012。丁苯酞軟膠囊由石藥集團恩必普藥業有限公司饋贈；氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)、CRP、TNF-α及IL-6 ELISA試劑盒均購自R&D；VCAM-1抗體及 II 抗均購自CST；SP試劑盒購自福州邁新生物技術開發有限公司；TRIzol、反轉錄試劑盒和SYBR Green熒光試劑盒均購自TaKaRa；低溫離心機(Thermo)；切片機(Leica)；光學顯微鏡(Olympus)；蛋白電泳及顯影系統(Bio-Rad)。

2實驗方法

2.1動物分組、模型復制及給藥90只雄性ApoE-/-小鼠隨機分為模型組及丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1組，每組30只，適應性喂養1周后，給予高脂飼料[含1.25%膽固醇、22.62%蛋白質、44.13%碳水化合物及20.06%油脂(豆油2.79%，可可脂17.27%)]復制動脈粥樣硬化模型，造模開始同時灌胃給予丁苯酞100 mg·kg-1·d-1及200 mg·kg-1·d-1進行干預。30只C57BL/6J作為正常對照組，給予維持飼料飲食。各組小鼠飼養于清潔級環境中，自由飲食飲水，維持12 h/12 h明暗交替，溫度(25±1) ℃，濕度55%～65%。實驗過程中，每周監測動物體重及進食進水量。在高脂飼喂(即給藥干預)12周及24周分別處死各組15只小鼠。實驗結束前禁食不禁水12 h，摘取眼球取血，4 ℃靜置30 min后，1 500 r/min離心15 min，取血清，-20 ℃保存待用。分離主動脈弓固定于4%甲醛，胸主動脈置于-80 ℃冰箱中保存待用。

2.2血清學指標的測定全自動生化儀檢測血清中總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(trigly-ceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量。按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量。

2.3病理學檢查固定完全的主動脈根部進行常規石蠟包埋，連續切片，片厚為4 μm。切片依次經二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，酸水及氨水中分色，伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。Image-Pro Plus 6.0 形態計量學測算斑塊面積及血管內外膜長度，回歸標準圓形后計算斑塊面積與血管管腔面積相對比值。

2.4RNA的提取和逆轉錄反應采用TRIzol兩步法抽提主動脈的總RNA，按照TaKaRa的反轉錄試劑盒要求反轉錄提取總RNA，10 μL 反應體系如下: RNA 1 μg，5× PrimeScript buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Prime (50 μmol/L) 0.5 μL，Random 6-mers (100 μmol/L) 0.5 μL，去RNA酶水4.5 μL。 反應條件為42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，最后得到的cDNA，-20 ℃保存備用。

2.5Real-time PCR檢測主動脈血管中VCAM-1的mRNA 表達采用實時熒光定量PCR 檢測VCAM-1的mRNA 表達，內參照為GAPDH，由大連寶生物設計引物序列。VCAM-1的上游引物為5’-ATTTTCTGGGGCAGGAAGTT-3’，下游引物為5’-ACGTCAGAACAACCGAATCC-3’；GAPDH 的上游引物為5’-AACTGCTTAGCACCCCTGGC-3’，下游引物為5’-ATGACCTTGCCCACACAGCCTT-3’。PCR反應體系為SYBR Prime Ex Taq (Tli RNaseH Plus) 10 μL，PCR上游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，PCR下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL，DNA 模板2 μL，dH2O 6.8 μL，按2-ΔΔCt法計算mRNA含量。

2.6Western blot法檢測主動脈血管中VCAM-1的蛋白表達胸主動脈約25 mg在0.5 mL蛋白裂解液中勻漿3次，每次間隔30 s，勻漿液4 ℃ 3 000×g離心15 min，收集上清，4 ℃ 12 000×g離心15 min，再次收集上清為總蛋白。蛋白濃度通過Bradford法檢測，計算各樣本中蛋白濃度。蛋白樣品經上樣緩沖液處理后，先進行5%～15% SDS-PAGE，160 V電泳后，4 ℃、100 V電泳轉膜2 h。轉移膜經5%、以TBST稀釋的脫脂奶粉室溫封閉2 h； I 抗(以TBST 1∶1 000稀釋)4 ℃過夜，用TBST振蕩沖洗3遍；II 抗(以TBST 1∶2 000稀釋)室溫作用2 h，用TBST振蕩沖洗3遍。轉移膜最后用ECL試劑盒顯色，凝膠成像儀拍照，Quantity One軟件分析。

3統計學處理

計量資料以均數±標準誤(mean±SEM)表示，所有統計分析均使用SPSS 13.0 統計軟件處理。組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05 為差異有統計學意義。

結果

1丁苯酞對模型小鼠體重及進食量的影響

各組小鼠體重變化及進食量情況如表1所示，與對照組相比，模型組小鼠在18周齡和30周齡時，體重均顯著高于平行對照組。灌胃給予丁苯酞100及200 mg·kg-1·d-1干預，小鼠體重與模型組相比無顯著差異。各組小鼠進食量在實驗過程中無明顯差異。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2丁苯酞對模型小鼠血脂水平的影響

各組小鼠血脂水平如表2所示，與對照組相比，模型組小鼠血清在18周齡和30周齡時TC、TG及LDL-C均顯著升高，HDL-C水平顯著下降，且30周齡后小鼠血脂變化較18周齡更顯著。造模之初即給予丁苯酞進行干預至18周齡和30周齡，可見100及200 mg·kg-1·d-1劑量組小鼠血清中TC、TG及LDL-C水平較模型組顯著降低，HDL-C含量顯著升高。且丁苯酞對模型小鼠血脂干預作用呈現一定劑量依賴性。

3丁苯酞對小鼠血清炎癥因子水平的影響

與對照組相比，模型組小鼠在18周齡和30周齡時血清中ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量均顯著增加，灌胃給予丁苯酞治療至18周齡和30周齡可劑量依賴性地降低模型小鼠血清升高的ox-LDL、CRP、TNF-α及IL-6含量，見表3。

4丁苯酞對模型小鼠主動脈粥樣硬化斑塊病理發展的影響

如圖1所示，對照組小鼠即野生型C57BL/6J小鼠在平行飼養至18周齡和30周齡時均可見主動脈壁薄厚均勻，內膜完整，內壁光滑無動脈粥樣硬化斑塊形成；模型組ApoE-/-小鼠高脂飼喂至18周齡的情況下可見主動脈內膜明顯增厚，內壁不光滑，局部可見明顯動脈粥樣硬化斑塊，呈現向管腔發展的占位性病變，高脂飼喂至30周齡，主動脈根部動脈粥樣硬化情況更嚴重；造模的同時給予丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1進行干預，至18周齡和30周齡時與平行模型組相比，均可見斑塊面積及病變程度均顯著減輕，且具有劑量依賴性。

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.05,##P<0.01vsmodel.

Figure 1. Observation of aortas in each group (HE staining, ×200).

圖1各組小鼠主動脈圖

各組小鼠主動脈粥樣硬化斑塊定量分析結果可見，模型組顯著高于對照組，丁苯酞低、高劑量組與模型組相比，粥樣硬化斑塊面積/動脈總面積顯著降低，見圖2。

5丁苯酞對模型小鼠主動脈VCAM-1 mRNA表達的影響

在18周齡和30周齡時，模型組小鼠主動脈VCAM-1的mRNA表達顯著高于平行對照組小鼠，灌胃給予丁苯酞100和200 mg·kg-1·d-1在18周齡和30周齡時后均可顯著降低模型小鼠主動脈中上調的VCAM-1的mRNA表達，并呈一定劑量依賴性。

Figure 2. Comparison of plaque area/lumen area in each group. Mean±SEM.n=15.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

圖2各組小鼠斑塊面積與管腔面積比值的比較

Figure 3. The mRNA level of VCAM-1 in the aortas of each group. Mean±SEM.n=15.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

圖 3各組小鼠主動脈中VCAM-1 mRNA水平

6丁苯酞對模型小鼠主動脈VCAM-1蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組小鼠主動脈VCAM-1蛋白表達均顯著升高；丁苯酞可劑量依賴性地降低模型小鼠主動脈中VCAM-1蛋白的表達，見圖4。

Figure 4. The protein level of VCAM-1 in the aortas of each group. Mean±SEM.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsmodel.

圖 4各組小鼠主動脈中VCAM-1蛋白水平

討論

AS是一種累及全身大、中動脈內膜的慢性炎癥性疾病，脂質代謝異常和炎癥反應是AS發生和發展的主要危險因素，目前學術界認可度較高的AS發病機制是Virchow的動脈粥樣硬化脂質浸潤學說[8]和經Ross完善的炎癥學說[1]。在高血脂等致炎因子的作用下，VCAM-1及ICAM-1等在介導單核細胞與血管內皮細胞黏附及其相互作用方面起到了關鍵作用，活化的黏附分子與單核細胞表面受體結合，促使單核細胞黏附到損傷的內皮上，因此這些黏附分子的激活與否影響著AS病變的形成與發展。VCAM-1是一種介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質間黏附及相互作用的膜表面糖蛋白，在內皮細胞、白細胞、血小板及平滑肌細胞表面表達。研究表明應用藥理途徑降低動脈粥樣硬化相關細胞黏附分子的表達或功能可阻抑或減慢AS發生[9]。ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族，可表達于白細胞、成纖維細胞、上皮細胞，尤其在血管內皮細胞中的表達最強。VCAM-1和ICAM-1在抗原表達過程中可以作為淋巴細胞的共刺激信號，在AS中進一步發揮作用。

對于VCAM-1及ICAM-1的激活的具體機制，有研究表明，高膽固醇血癥發生時，體內抗氧化因子活性降低，氧自由基生成增多，LDL經氧自由基修飾形成ox-LDL，其可激活血管內皮細胞NF-κB及TNF-α，誘導或上調VCAM-1。另有研究證實，CRP可刺激單核細胞釋放炎癥介質IL-6和TNF-α誘發血管炎癥，且通過加重血管內皮損傷，促進平滑肌細胞增殖與遷移，上調VCAM-1的表達，激活補體系統，促進血栓形成，參與AS的形成及發展。

本實驗研究中選用的ApoE-/-小鼠，是目前公認的進行藥物抗動脈粥樣硬化活性篩選及作用機制的最經典的動物模型之一[10]，而C57BL/6J小鼠與其具有相同的遺傳背景，在研究中常作為正常對照組。ApoE-/-小鼠在正常飲食及高脂飲食情況下血脂均會升高，且其發病機制與人類動脈粥樣硬化形成過程相似。已有研究報告，ApoE-/-小鼠在5～6周齡時主要是單核細胞趨附于損傷的內皮細胞處，8～10周齡出現脂紋，15～20周齡后逐漸出現纖維斑塊，病變部位以主動脈根最為明顯，其次為胸主動脈[11]。本實驗中持續給予ApoE-/-小鼠高脂飼喂12周即18周齡，可見模型組小鼠血脂水平顯著升高，并且主動脈發生動脈粥樣硬化斑塊沉積。且血清中炎癥因子CRP、TNF-α及IL-6高表達。根據以上論述內容，高血脂及升高的炎癥因子水平會誘導黏附因子VCAM-1的高表達，本實驗結果從蛋白及mRNA水平均證實了這一點，但值得注意的是30周齡時模型組血脂和炎癥因子水平高于18周齡小鼠，動脈粥樣硬化情況亦較為嚴重，但30周齡模型組小鼠胸主動脈中VCAM-1 mRNA及蛋白水平確低于18周齡小鼠，可以看出VCAM-1是動脈粥樣硬化發生早期一個重要的致病因素。造模初期即給予丁苯酞持續干預12周及24周后，可見血脂及炎癥因子均劑量依賴性地降低，VCAM-1的蛋白和mRNA水平均顯著下降，可見丁苯酞是同時通過降低血脂及減少炎癥因子，進而降低VCAM-1在主動脈中的表達，抑制或延緩AS的發生。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)

Effects of butylphthalide on atherosclerosis lesion and VCAM-1 expression in aortic wall of ApoE-/-mice

GAO Na1, YANG Qing-yu2, LIU Xiu-mei2

(1DepartmentofPharmacy,AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,HenanCancerHospital,2DepartmentofPharmacy,People’sHospitalofZhengzhou,Zhengzhou450000,China.E-mail:gn_submit@163.com)

[KEY WORDS]Butylphthalide;ApoE-/-mice; Atherosclerosis; Vascular cell adhesion molecular-1

[ABSTRACT]AIM: To observe the protective effects of butylphthalide on atherosclerosis lesion and vascular cell adhesion molecular-1 (VCAM-1) expression in the aortic wall ofApoE-/-mice, and to explore the possible mechanism underlying these beneficial effects.METHODS: MaleApoE-/-mice at 6 weeks of age (n=90) were randomly divided into 3 groups. ThirtyApoE-/-mice fed with high-fat diet and treated with saline simultaneously were defined as model group. ThirtyApoE-/-mice fed with high-fat diet and treated with butylphthalide (100 and 200 mg·kg-1·d-1) were defined as treatment groups. Thirty wild-type C57BL/6J mice treated with saline were defined as control group. Fifteen mice in each group were sacrificed both at the ages of 18 and 30 weeks. The body weight, food intake and water intake were monitored weekly through the experiment. The lipid profiles were determined both at 18 and 30 weeks of age. Aortic roots were stained with hematoxylin and eosin for pathological examination. Serum ox-LDL, CRP, TNF-α and IL-6 were examined by ELISA. The expression of VCAM-1 at mRNA and protein levels was determinate by real-time PCR and Western blot in the thoracic aortas. RESULTS: Compared with control group, at 18 and 30 weeks of age, the body weight, serum lipid profiles and inflammatory factors were increased, while the atherosclerotic plaques were raised. The mRNA and protein levels of VCAM-1 were up-regulated. However, serum lipid levels in butylphthalide treatment groups (both at doses of 100 and 200 mg·kg-1·d-1) were decreased significantly. Serum ox-LDL, CRP, TNF-α and IL-6 were also decreased by butylphthalide treatment. Furthermore, atherosclerotic plaque areas in the aortic roots were reduced by butylphthalide treatment. In addition, the expression of VCAM-1 at mRNA and protein levels in the thoracic aortas was down-regulated by butylphthalide treatment.CONCLUSION: Butylphthalide delays the occurrence of high-fat diet-induced atherosclerosis and down-regulates the expression of VCAM-1 in theApoE-/-mice, which may be due to its alleviative effects on hyperlipidemia and inflammation.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1037- 06

[收稿日期]2015- 06- 12[修回日期] 2016- 03- 22

通訊作者△Tel: 0371-65588134; E-mail: gn_submit@163.com

[中圖分類號]R541.4; R972+.6

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.013