長鏈非編碼RNA linc-STXBP5-1在宮頸癌中的表達及其干預效應分析*

鄒阮敏，　余　霞，　張文淼，　陳冠閣，　朱　華△，　蘇華芳

(溫州醫科大學附屬第一醫院1婦產科，2病理科，3放化療科，浙江 溫州 325000)

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長鏈非編碼RNA linc-STXBP5-1在宮頸癌中的表達及其干預效應分析*

鄒阮敏1，余霞2，張文淼1，陳冠閣1，朱華1△，蘇華芳3△

(溫州醫科大學附屬第一醫院1婦產科，2病理科，3放化療科，浙江 溫州 325000)

[摘要]目的： 檢測長鏈非編碼RNA linc-STXBP5-1在宮頸癌組織中的表達及意義，細胞學水平分析其對宮頸癌細胞活力及侵襲力的影響。方法: Real-time PCR檢測48例宮頸鱗癌組織、9例宮頸上皮內瘤變(CIN)Ⅱ-Ⅲ、20例CINⅠ和20例正常宮頸組織 linc-STXBP5-1的表達水平；分析linc-STXBP5-1在不同病理級別和臨床分期宮頸鱗癌中的表達情況； linc-STXBP5-1 siRNA干預HPV16(+) SiHa宮頸癌細胞后，檢測細胞活力；Transwell侵襲實驗檢測沉默linc-STXBP5-1后SiHa宮頸癌細胞的侵襲能力；最后檢測linc-STXBP5-1在宮頸癌細胞胞漿及胞核的定位表達。結果: 宮頸鱗癌及CINⅡ-Ⅲ組織linc-STXBP5-1表達明顯高于CINⅠ及正常宮頸組織(P<0.05)；宮頸鱗癌與CINⅡ-Ⅲ之間以及CINⅠ與正常宮頸組織間linc-STXBP5-1表達差異無統計學顯著性；linc-STXBP5-1表達與宮頸癌臨床病理分析顯示，病理分級屬于G3的宮頸鱗癌組織linc-STXBP5-1的表達量明顯高于G1、G2組織(P<0.05)；臨床分期中屬于Ⅲ和Ⅳ期的宮頸鱗癌組織也明顯高于Ⅰ和Ⅱ期(P<0.05)；linc-STXBP5-1表達水平與不同年齡、腫瘤直徑和腫瘤類型未見顯著相關性。利用siRNA下調SiHa宮頸癌細胞linc-STXBP5-1表達后，細胞活力和侵襲能力顯著降低；定位表達分析提示linc-STXBP5-1主要表達于宮頸癌細胞的細胞核中，僅有少許表達于細胞漿中。結論: 腫瘤組織上調表達的linc-STXBP5-1可作為促癌基因參與宮頸癌的發生發展過程。

[關鍵詞]長鏈非編碼RNA； 宮頸癌； 細胞活力； 細胞侵襲

非編碼RNA(noncoding RNA，ncRNA)，尤其是轉錄本長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)與腫瘤的關系近年來受到重視。許多研究均證實，異常表達的lncRNA參與了多種腫瘤的發生發展進程[1-2]。Linc-STXBP5-1是一條定位于Chr6:147480061-147502128、長度為453 nt的lncRNA。我們前期的lncRNA表達譜芯片檢測顯示，與正常宮頸組織比較，linc-STXBP5-1在宮頸癌組織中表達明顯上調。本研究進一步檢測48例宮頸癌組織、19例宮頸上皮內瘤變(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)Ⅱ-Ⅲ、20例CINⅠ及20例正常宮頸組織linc-STXBP5-1的表達，分析其表達與宮頸癌臨床病理特征的關系，并在細胞水平進行干預，分析細胞基本生物學特征的變化，探討其在宮頸癌發生、發展中可能的調控作用及意義。

材料和方法

1實驗材料

SiHa宮頸癌細胞株購自中科院上海科學研究所細胞庫；DMEM培養基、胎牛血清、Opti-MEM培養基、0.05% trypsin、脂質體(Lipofectamine 2000) 和TRIzol試劑購自Invitrogen；ReverTra Ace逆轉錄試劑盒、SYBR Master Mix等購自Toyobo；胞核和胞漿蛋白提取試劑盒購自Thermo Fisher；Matrigel購自BD Bioscience；Transwell小室購自Costar；CCK-8試劑盒購自Dojindo。siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成，引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

2實驗方法

2.1標本采集48例宮頸鱗癌組織取自溫州醫科大學附屬第一醫院2012年1月～2014年9月就診患者，活檢取材，之前均未行手術和放、化療?；颊吣挲g34～70歲，中位年齡48.7歲。腫瘤直徑<4 cm 19例，≥4 cm 29例。腫瘤類型：外生型19例，內生型15例，潰瘍型10例，頸管型4例。病理分級：G1 10例，G2 14例，G3 24例。臨床分期：按國際婦產科聯盟(FIGO)的分期標準，Ⅰ期8例，Ⅱ期26例，Ⅲ～Ⅳ期14例。19例CINⅡ-Ⅲ患者年齡31～58歲，中位年齡45.6歲。20例CINⅠ患者年齡34～55歲，中位年齡41.4歲。另取同期年齡匹配的應子宮肌瘤手術的正常宮頸組織20份作對照。標本離體后30 min內置于液氮保存。宮頸癌、CIN診斷及常規病理資料由2位病理科醫師盲法閱片后提供。

2.2RNA的提取取液氮保存的組織標本，在液氮中碾碎至粉狀，按TRIzol試劑說明書提取總RNA。為去除可能污染的DNA，抽提的RNA經DNaseⅠ處理、酚-氯仿抽提后，純化的RNA以DEPC水溶解。利用Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA濃度和完整性。 提取SiHa細胞RNA，依照胞漿胞核分離提取試劑盒操作。

2.3Linc-STXBP5-1表達的檢測參照ReverTra Ace逆轉錄試劑盒說明書，取4 μg總RNA以隨機引物(hexamer)進行逆轉錄。反應條件為42 ℃ 60 min、75 ℃ 15 min, 反應結束后-20 ℃保存。以20 μL反應體系進行定量PCR檢測。表1為相關的引物序列。定量熒光PCR反應體系包括1 μL 逆轉錄產物、1×SYBR Green I Master Mix、0.5 μmol/L特異前向引物和0.5 μmol/L 特異反向引物。反應條件為95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min，40 個循環。Real-time PCR使用ABI Step One儀器進行。所有樣品做3復孔。根據待測標本的Ct值，以GAPDH作為內參照，采用2-ΔΔCt法計算目的基因表達。

2.4Linc-STXBP5-1干預對細胞活力的檢測HPV16(+) SiHa宮頸癌細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基, 置于37 ℃、含5% CO2飽和濕度培養箱內培養, 2～3 d傳代 1 次。狀態良好的細胞以每孔1×105細胞(100 μL)接種96孔板，linc-STXBP5-1 siRNA轉染細胞，設20 nmol、40 nmol/L和80 nmol/L 3個不同濃度的siRNA干預組、無關序列對照組及不含siRNA的空白組。按Lipofectamine 2000說明書轉染細胞。轉染48 h后，加入CCK-8溶液(每孔10 μL)，繼續培養4 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

2.5Transwell侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力按Costar 24-Well TranswellTM說明書操作。將凍存于-20 ℃的Matrigel 4 ℃過夜預冷成液態，無血清培養液將Matrigel冰上操作1∶1稀釋，混勻后加入Transwell小室，每孔15 μL。37 ℃包被1 h，無血清培養液洗3次后備用。消化SiHa細胞后用無血清培養液洗2次，計數。向上部培養嵌室內加入細胞懸液(含1×105個細胞)并加入無血清DMEM稀釋至400 μL，每組設3個復孔。向底部培養室加入600 μL含15% FBS的DMEM完全培養液。37 ℃、5% CO2培養24 h。吸去嵌室內的液體，用棉棒擦去嵌室底部內表面上的細胞，將嵌室浸入固定液(50%甲醇)固定15 min，PBS洗3遍。結晶紫染色30 min。風干后，熒光顯微鏡下每個培養孔隨機選擇6個視野拍照計數并計算每個視野的平均數。

3統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件進行統計處理。宮頸組織linc-STXBP5-1表達以中位數和四分位數間距表示，兩組間差異分析采用Mann-WhitneyU檢驗，多組差異表達分析采用Kruskal-WallisH檢驗；細胞實驗的數據以均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析及Bonferroni檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結果

1宮頸鱗癌、CIN及正常宮頸組織linc-STXBP5-1的表達

以GAPDH為內參照，linc-STXBP5-1在宮頸鱗癌、CINⅡ-Ⅲ、CINⅠ及正常宮頸組織中的相對表達量分別為16.73(3.92，28.49)、12.46(5.55，17.50)、4.46(0.91，7.21)和2.05(0.58，3.20)。秩和檢驗結果表明，宮頸鱗癌及CINⅡ-Ⅲ的linc-STXBP5-1表達明顯高于CINⅠ及正常宮頸組織(P<0.05)，且宮頸鱗癌與CINⅡ-Ⅲ之間以及CINⅠ與正常宮頸組織間linc-STXBP5-1表達差異無統計學顯著性，見圖1。

Figure 1.Expression of linc-STXBP5-1 in cervical cancer (CC), CINⅡ-Ⅲ, CINⅠ and normal cervical (NC) tissues.*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsCINⅠ.

圖1宮頸鱗癌、CINⅡ-Ⅲ、CINⅠ及正常宮頸組織中linc-STXBP5-1的表達水平

2Linc-STXBP5-1表達與宮頸鱗癌臨床病理特征相關性分析

如表2 所示，linc-STXBP5-1表達在不同病理分級及臨床分期的宮頸鱗癌組織存在明顯差異(P<0.05)，病理分級屬于G3的宮頸鱗癌組織linc-STXBP5-1的表達量明顯高于G1、G2組織(P<0.05)；臨床分期中屬于Ⅲ和Ⅳ期的宮頸鱗癌組織也明顯高于Ⅰ和Ⅱ期(P<0.05)。Linc-STXBP5-1表達水平與不同年齡、腫瘤直徑和腫瘤類型未見顯著相關性。

表2Linc-STXBP5-1表達與宮頸癌臨床病理因素的相關性分析

Table 2.Correlation between clinicopathological features and linc-STXBP5-1 expression in 48 specimens

*The data were presented as median and interquatile range.

3沉默linc-STXBP5-1的對宮頸癌細胞惡性生物學行為的影響

為分析linc-STXBP5-1的效應，本研究進一步利用siRNA沉默HPV16(+) SiHa細胞株中linc-STXBP5-1表達。20、40和80 nmol/L siRNA干預均可明顯降低細胞內linc-STXBP5-1的表達。40 nmol/L siRNA與50 nmol/L siRNA干擾效果差異無統計學意義，為此選擇40 nmol/L 進行后續干預實驗。如圖2所示，40 nmol/L siRNA干預后，CCK-8法檢測發現細胞活力顯著降低。如圖3所示，Transwell小室侵襲實驗檢測遷移侵襲能力發現，沉默linc-STXBP5-1可顯著降低細胞的侵襲能力。

Figure 2. The viability of SiHa cells after by silencing of linc-STXBP5-1.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal control (NC).

圖2沉默linc-STXBP5-1對SiHa細胞活力的影響

Figure 3.The cell invasion after silencing of linc-STXBP5-1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsNC.

圖3沉默linc-STXBP5-1對SiHa細胞侵襲能力的影響

4Linc-STXBP5-1在宮頸癌細胞的定位表達分析

利用胞漿胞核分離提取試劑盒，分別提取SiHa細胞的胞漿及胞核RNA，利用real-time PCR方法檢測linc-STXBP5-1的表達水平，如圖4，結果發現該lncRNA主要表達于細胞核中，僅有少許表達于細胞漿中。

Figure 4.The subcellular localization of linc STXBP5-1 expressed in the SiHa cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscytoplasm.

圖4linc-STXBP5-1在SiHa細胞株中的亞細胞定位表達

討論

近年越來越多的研究表明，lncRNA在轉錄水平、轉錄后水平以及表觀遺傳等多個層面參與了X染色體沉默、基因組印記以及染色質修飾、轉錄激活、轉錄干擾、核內運輸等多種重要的調控過程[3]，異常表達的lncRNA不但是腫瘤特異標記物，也可以作為腫瘤治療的分子靶點[4]。但lncRNA與宮頸癌關系的研究目前尚處于起步階段。有報道MALAT1、HOTAIR、CCHE1、CCAT2、CET、EBIC等lncRNA的上調表達和MEG3、LET及GAS5等的下調表達參與促進宮頸癌的發生發展[5-10]。

Linc-STXBP5-1是一條定位于人染色體6q24.3、長度為453 nt的典型基因間lncRNA[11]。其功能迄今尚未有相關研究報道。我們前期lncRNA表達譜芯片檢測顯示，與正常宮頸組織比較，linc-STXBP5-1在宮頸癌組織中表達明顯上調。本研究通過real-time PCR進一步證實了芯片篩選的結果。分析其在CINⅡ-Ⅲ和CINⅠ組織表達顯示，linc-STXBP5-1不但在宮頸癌，而且在CINⅡ和Ⅲ的表達也明顯高于CINⅠ及正常宮頸組織。與宮頸癌臨床病理特征相關分析顯示，病理分級屬于G3的宮頸鱗癌組織linc-STXBP5-1的表達量明顯高于G1、G2組織，臨床分期中屬于Ⅲ和Ⅳ期的宮頸鱗癌組織明顯高于Ⅰ和Ⅱ期宮頸鱗癌組織。沉默宮頸癌細胞linc-STXBP5-1表達后，可顯著降低其活力及侵襲能力，提示linc-STXBP5-1是宮頸癌的一個新的促癌基因。既往的研究發現，宮頸腫瘤組織上調表達的MALAT1和HOTAIR可促進宮頸癌細胞活力、侵襲和遷移，可作為宮頸癌不良預后的一個生物標志[9,12-15]。本研究發現的linc-STXBP5-1也將是一個新的宮頸癌診斷生物標志及潛在的治療靶點。

目前僅少數的lncRNA在宮頸癌中的作用機制被闡明。MALAT1可通過miR-124、miR-145及上皮細胞轉分化等作用參與宮頸癌的發展[12,16-17]，而HOTAIR不但可通過調節VEGF、MMP-9及其它EMT相關基因表達促進宮頸癌細胞增殖遷移[13-15]，而且可抑制p21促進宮頸癌惡性表型和放射治療的抵抗[18]。但是，關于linc-STXBP5-1調控機制迄今尚無相關研究報道。本研究通過檢測細胞核和細胞漿中的表達情況，發現linc-STXBP5-1主要分布于細胞核內。研究顯示，約50%的lincRNA可通過招募多種染色質修飾復合物，如PCR2蛋白復合體，發揮表觀遺傳學調控作用[19]。而基因組染色體上linc-STXBP5-1相鄰的區域含TCF21、SYNE1、AKAP12、IL20RA、ACAT2等高度甲基化的抑癌基因[20]。是否linc-STXBP5-1通過招募染色體修飾復合物影響其鄰近區域抑癌基因啟動子區的表觀遺傳學調控有待進一步研究。

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(責任編輯： 林白霜， 羅森)

Expression and intervention effect of long noncoding RNA linc-STXBP5-1 in cervical cancer

ZOU Ruan-min1, YU Xia2, ZHANG Wen-miao1, CHEN Guan-ge1, ZHU Hua1, SU Hua-fang3

(1DepartmentofObstetrics&Gynecology,2DepartmentofPathology,3DepartmentofRadiationOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325000,China.E-mail: 23444176@qq.com; 12602639@qq.com)

[KEY WORDS]Long noncoding RNA; Cervical carcinoma; Cell viability; Cell invasion

[ABSTRACT]AIM: To determine the expression of long noncoding RNA linc-STXBP5-1 in cervical cancer and its clinical significance, and to further explore its effect on the viability and invasion of cervical cancer cell line.METHODS: The expression levels of linc-STXBP5-1 in the cervical squamous-cell carcinoma tissues, cervical intraepithelial neoplasia (CIN)Ⅱ-Ⅲ, CINⅠ, and normal cervical tissues were detected by real-time PCR. The correlation between linc-STXBP5-1 expression and clinicopathological features of cervical cancer was further analyzed. Linc-STXBP5-1 knockdown was established by transfecting siRNA into human cervical cancer SiHa cells. The effect of linc-STXBP5-1 on cell viability and invasion ability was evaluated by CCK-8 assay and transwell assay, respectively. To determine the subcellular localization of linc-STXBP5-1 expression, the nuclear and cytoplasmic RNA fractions were isolated, and linc-STXBP5-1 expression was quantified by real-time PCR.RESULTS: Compared with CINⅠand normal cervical tissues, the level of linc-STXBP5-1 was significantly upregulated in the cervical squamous-cell carcinoma and CINⅡ-Ⅲ (P<0.05). No significant difference was observed either between the cervical squamous-cell carcinoma and CINⅡ-Ⅲ, or between CINⅠ and the normal cervical tissues. The clinical correlation analysis suggested that linc-STXBP5-1 expression in G3 cervical squamous-cell carcinoma tissues was obviously higher than that in G1 and G2 (P<0.05). At the same time, linc-STXBP5-1 expression in the cervical squamous-cell carcinoma with stage Ⅲ -Ⅳ was significantly higher than that with stage Ⅰ-Ⅱ (P<0.05). The expression level of linc-STXBP5-1 did not relate to age, tumor size and tumor type. Knockdown of linc-STXBP5-1 expression by siRNA reduced the viability and invasion in HPV16 (+) SiHa cervical cancer cells. Analysis of subcellular localization indicated that the transcript of linc-STXBP5-1 was mainly expressed in the nucleus of SiHa cells, rarely in cytoplasm. CONCLUSION: The upregulation of linc-STXBP5-1 expression may function as an oncogene in the development and progression of cervical carcinoma.

[文章編號]1000- 4718(2016)06- 1127- 06

[收稿日期]2016- 03- 24[修回日期] 2016- 04- 26

*[基金項目]浙江省自然科學青年基金科研資助項目(No. LQ15C010002);溫州市科技局科研基金資助項目(No. Y20140308)

通訊作者△Tel: 0577-88069216; E-mail: 朱華 23444176@qq.com; 蘇華芳 12602639@qq.com

[中圖分類號]R730.23；R711.74

[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.06.028