全細胞膜片鉗技術在神經元鈣通道藥理研究中的應用

林智穎,張　靜,黃天文,陳曉春

(福建醫科大學附屬協和醫院，福建省老年醫學研究所，福建省神經生物學研究中心，福建 福州　350001)

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全細胞膜片鉗技術在神經元鈣通道藥理研究中的應用

林智穎,張靜,黃天文,陳曉春

(福建醫科大學附屬協和醫院，福建省老年醫學研究所，福建省神經生物學研究中心，福建 福州350001)

全細胞膜片鉗技術是研究離子通道和藥物對離子通道影響的最重要的技術之一，但是由于其對實驗技術要求高，對實驗標本制備和實驗環境、實驗用溶液等條件均有嚴格要求等原因致使其在實際運用中較為困難。本文報告了運用全細胞膜片鉗技術進行神經元鈣通道藥理研究的一些經驗。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物和試劑孕期(19±1) d清潔級的SD大鼠由中國科學院上海生命科學院動物中心提供，人參皂苷Rb1購自吉林大學基礎醫學院有機化學實驗室。nifedipine、BayK8644、glutamate等購自美國Sigma公司，溶液中的電解質均為國產分析純。

1.1.2主要儀器MP-285微操縱儀(Burleigh, 美國)，CCD Evolution QEi (monochrome)(Media Cybernetics，加拿大)，EPC9 triple放大器、Patchmaster2.1數據采集分析軟件(Heka, 德國)，P-97電極拉制儀(Sutter Ins, 美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養海馬神經元的混合培養參照Zhang等[1]的方法并稍加改進。取d 7的細胞用于電生理記錄。

1.2.2電生理記錄電極內液包括：80 mmol·L-1Cs-methanesulfonate, 20 mmol·L-1tetraethylammonium chloride(TEA-Cl), 1 mmol·L-1CaCl2, 5 mmol·L-1MgCl2, 11 mmol·L-1EGTA, 10 mmol·L-1HEPES, 10 mmol·L-1Na2ATP；用CsOH將pH調整至7.2～7.3，用蔗糖將滲透壓調至300 mOsm。 細胞外液包括：115 mmol·L-1choline-Cl, 25 mmol·L-1TEA-Cl, 5 mmol·L-14-aminopyridine(4-AP), 5 mmol·L-1BaCl2, 10 mmol·L-1glucose,10 mmol·L-1HEPES, 0.000 5 mmol·L-1tetrodotoxin(TTX)；用Tris將pH調整至7.2～7.3，用蔗糖將滲透壓調至300 mOsm。本實驗記錄的是電壓門控的鈣通道鋇電流(voltage-gated calcium channel Ba2+current, IBa)，采用鉗制電壓設定在-50 mV，階梯式給予從-70 mV到+70 mV指令電壓的激活程序，從-60 mV去極化到0 mV的藥物作用程序。

1.2.3實驗給藥及處理細胞外灌流使用改良的Y管給藥裝置[2-3]。形成全細胞記錄模式[4]后，開啟Y管給藥裝置，從細胞一側微灌流事先配制好的含所需藥物濃度的細胞外液，所有細胞均在細胞破膜后3～5 min記錄到的電流穩定時才給藥。

2　結果

2.1適合膜片鉗記錄的原代培養神經元以60 000 cells·mL-1的密度種植于培養皿中經7 d培養后的神經元，在相差顯微鏡下觀察有活力的神經細胞一般具有形狀近似錐形或三角形、表面完整光滑、胞體均一明亮、周圍光暈明顯等特點。

2.2藥理研究的給藥系統Y管給藥裝置中Y管給藥尖端距離目標細胞50～100 μm，藥液高于Y管口30～50 cm以便其有足夠的重力流出。實驗中給藥尖端的位置以100 μmol·L-1谷氨酸作為參照，通過“Y-tube”灌流100 μmol·L-1谷氨酸誘導出一個快速的內向電流及隨之的穩態電流，洗脫后基本恢復至基線。

2.3電壓門控的鈣通道電流的記錄在本實驗條件下，通過在細胞內外液中分別加入特異性的抑制劑，電壓門控的鈉電流及鉀電流被阻斷；將鉗制電壓設定在-50 mV，階梯式給予指令電壓可記錄到一束內向Ba2+電流。記錄到的內向Ba2+電流對L-型通道特異性的抑制劑硝苯地平和L-型通道激動劑BayK8644反應靈敏。

2.4藥物對電壓門控的鈣通道的影響細胞外灌流20 μmol·L-1人參皂苷Rb1，IBa2+峰電流密度值(pA/pF)分別比給藥前降低(23±3.49)%(n=3,P>0.05)。Rb1對鈣電流的阻斷是可逆的，在洗脫后幾乎回復到基線。加入20 μmol·L-1人參皂苷Rb1后，最大的電流峰值由加藥前的(721.60±53.63) pA減少至(556.00±50.70) pA。Rb1明顯減少神經細胞的IBa2+峰值(P<0.01,n=3)。同時Rb1對VGCC激活電位及反轉電位均無明顯影響。

3　討論

神經細胞的制備、細胞封接和破膜、給藥系統的配置等諸多環節均可影響膜片鉗實驗的成敗。我們先前的實踐證實在本培養系統下，培養的海馬神經元既保留了鈣通道的電生理特性[5]，又克服了急性分離后狀態好的細胞數量有限、細胞狀態難以長時間保持等缺點；細胞在破膜記錄到穩定電流后仍能保持較好的狀態，有利于藥物干預后較長時間的觀察。

Y管給藥裝置可自制，材料價格低廉，易于安裝。Y管給藥使我們能迅速準確地觀察到通道對藥物的反應以及其隨時間變化的趨勢，也實現了在同一細胞上序貫給予多種藥物干預的可能；使狀態好的細胞得到了更高效地利用[2-3]。我們記錄了20 μmol·L-1Rb1對VGCC的影響以及電流在藥物作用前后隨時間的變化，在此基礎上通過對電流-電壓關系曲線圖的分析可以了解Rb1對VGCC激活電位、最大激活電位及反轉電位的影響；或者藥物對穩態激活曲線和穩態失活曲線的影響[6]；從而客觀分析藥物對通道功能狀態的影響。

(致謝：感謝浙江大學醫學部段樹民教授給予的技術指導！)

[1]Zhang J M,Wang H K,Ye C Q,et al. ATP released by astrocytes mediates glutamatergic activity-dependent heterosynaptic suppression[J].Neuron,2003,40(5):971-82.

[2]Bretschneider F,Markwardt F. Drug-dependent ion channel gating by application of concentration jumps using U-tube technique[J].MethodsEnzymol, 1999, 294: 180-9.

[3]Duan S,Cooke I M. Selective inhibition of transient K+current by La3+in crab peptide-secretory neurons[J].JNeurophysiol, 1999, 81(4):1848-55.

[4]周麗，李威，唐明.花生四烯酸乙醇胺對大鼠心肌細胞L型鈣電流的影響[J]. 中國藥理學通報，2013，29(10):1391-4.[4]Zhou L,Li W,Tang M.Effect of anandamide on L-type calcium current in cardiomyocytes of rats[J].ChinPharmacolBull,2013,29(10):1391-4.

[5]林智穎，陳曉春， 張靜，等.原代培養海馬神經元的多種電壓門控鈣通道電流成分[J].生理學報，2012，64(6)：687-91.

[5]Lin Z Y,Chen X C,Zhang J,et al.Diverse components of voltage-gated calcium current in primary cultured hippocampal neurons[J].ActaPhysiolSin, 2012, 64(6): 687-94.

[6]Lin Z Y, Chen L M, Zhang J, et al.Ginsenoside Rb1 selectively inhibits the activity of L-type voltage-gated calcium channels in cultured rat hippocampal neurons[J].ActaPharmacolSin, 2012,33(4): 438-44.

Application of whole cell patch clamp technique in pharmacological study of calcium channels in neurons

LIN Zhi-ying, ZHANG Jing, HUANG Tian-wen, CHEN Xiao-chun

(FujianInstituteofGeriatrics,theAffiliatedUnionHospitalofFujianMedicalUniversity;ResearchCenterofNeurobiology,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China)

全細胞膜片鉗技術；海馬神經元；電壓門控的鈣通道；人參皂苷Rb1；原代培養；Y管

whole cell patch clamp; hippocampal neuron; voltage-gated calcium channels; ginsenoside Rb1；primary culture; Y-tube

2016-04-24,

2016-05-29

國家自然科學基金資助項目(No 30772555)；福建省自然科學基金資助項目(No 2013J01311)；福建省醫學創新課題(No 2012-CX-15)；福建省中醫藥科研項目(No wzkf201309)

林智穎(1972-)，男，博士，副教授，研究方向：老年性癡呆基礎和臨床，E-mail：lzy8426@126.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.09.028

A

1001-1978(2016)09-1327-02

網絡出版時間：2016-8-23 14:29:00網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20160823.1429.056.html