骨髓間充質干細胞在心肌組織工程中的研究與進展

孫國棟 郭光偉

（山西醫科大學，山西 太原 030001）

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骨髓間充質干細胞在心肌組織工程中的研究與進展

孫國棟 郭光偉

（山西醫科大學，山西 太原 030001）

【摘要】骨髓間充質干細胞因其具有高度增殖能力，多向分化潛能等優點已經引起了人們對骨髓間充質干細胞的研究熱潮，尤其是做為組織工程及心血管疾病細胞移植治療的理想種子細胞方面。常規用于房間隔或室間隔缺損修補手術的補片為滌綸補片，它具有質量輕、質地薄、生物相容性較好等優點，但近幾年發現，用其修補后，如若發生術后殘余漏，較易引起溶血、真菌或細菌感染。因此利用骨髓間充質干細胞的多向分化潛能在體外構建一種含有類心肌樣細胞具有生物活性的補片是目前亟待解決的問題。但骨髓中的間充質干細胞含量極低，需經體外分離，純化，擴增并吸附于一種生物相容性良好并可被機體吸收的生物材料上形成復合物，然后將其復合物植入機體組織或器官病損部位，才能達到修復缺損心肌和梗死后心肌組織的目的。

【關鍵詞】骨髓間充質干細胞；組織工程；心肌樣細胞

隨著科學技術的發展，組織工程的興起，骨髓間充質干細胞（BMSCs）在組織工程學中作為種子細胞使用也越來越受到人們的關注。骨髓間充質干細胞來自于中胚層，于全身結締組織和器官間質中均存在，但含量極少［1］。相比較而言，BMSCs在骨髓中的含量最多，為骨髓中的非造血干胞，對骨髓中的造血干細胞有機械支持作用，也可以分泌許多生長因子（如ILIF、L-11、IL-6、M-CSF及SCF等）支持造血。所以獲得生長狀態良好、較純化和足夠數量的BMSCs是組織工程研究實驗的基礎。人們在研究中發現BMSCs對塑料培養材料的貼壁特性，過去又被稱為塑料貼壁細胞。它體外培養增殖較為容易，同時還具有無免疫原性和多向分化的潛能。在一定的體外環境下可以分化成為心肌樣細胞，本文就BMSCs誘導成心肌樣細胞研究進展做如下綜述。

1 研究背景

隨著人們生活節奏的加快，生活方式的改變，心血管系統方面的疾病呈逐年增長的趨勢。但心肌細胞是不可再生細胞，現有的醫學手段也只能從營養心肌細胞，降低心肌氧耗來改善心臟功能。因此尋找一種能替代壞死心肌細胞的新的種子細胞成為我們的迫切需求。骨髓間充質干細胞（BMSCs）最原始的命名為骨髓基質成纖維細胞，它屬于成體干細胞，主要來源于中胚層，可在體內外分化為成骨細胞、脂肪細胞、肌肉細胞，心肌樣細胞等。1995年，Wakitani等［2］首先證實骨髓間充質干細胞在體外經5-氮雜胞苷誘導后分化成心肌樣細胞，分化率約為30%。引起了對骨髓間充質干細胞的研究熱潮。屈佳等［3］體外模擬心肌環境用心肌細胞凍融液誘導MSCs向心肌細胞分化發現：在心肌細胞凍融液的環境中培養的MSCs，細胞生長旺盛，有大量子代形成。同時還發現心肌細胞凍融液可將具有多能分化潛能的MSCs誘導為包括心肌細胞、血管內皮細胞在內的一個細胞群體，與5-Aza單一的心肌細胞誘導作用相比，更能提供一個適合心肌再生所需的自然條件。Kadner［4］等以成人BMSCs為種子細胞，進行體外擴增，然后進行基因修飾借助于生物材料載體將其回植入體內，可用于心血管組織工程。Krupnick等［5］將鼠BMSCs種植在三維支架上，并將細胞－支架復合物移植在同系基因型鼠的左心室，研究結果表明，BMSCs種植在三維細胞支架上有向心肌分化的潛力。

2 BMSCs的分離方法

2.1 全骨髓貼壁法：這是骨髓間充質干細胞最早的分離方法，將抽取的骨髓直接加入培養液制成細胞懸液，以合適的細胞濃度進行接種培養，它是利用BMSCs對塑料底的貼附性，定期換液去除懸浮生長的造血系細胞，進行分選純化而得。這種方法得到的BMSCs形態多呈梭形、呈集落生長，而且成分復雜，均一性差，抗原特異性差異也較大。

2.2 密度梯度離心法：根據骨髓中細胞成分的比重不同，能有效地將紅細胞、白細胞和間充質干細胞分離開來，然后將分離出來的骨髓間充質干細胞進行貼壁培養。這類細胞同源性更強，且有更強的自我更新能力和多向分化潛能，同時操作簡便、快速，對細胞的活性影響較小。

2.3 流式細胞儀分離法：不同種類細胞都有其自身特殊的細胞標志并且其體積大小也不同，將分理出的細胞與有熒光標記的特異性抗體相結合，制做成特定濃度的細胞懸液，放入流式細胞儀機器中，然后經激光照射，發出的熒光信號將被轉化成電信號，再由計算機對其進行處理，這樣就把陽性表達的細胞與陰性表達的細胞分離開了。

2.4 免疫磁珠分離法：將BMSCs的表面特異性抗原與連接有磁珠的特異性抗體相結合，形成帶有磁珠的，抗原-抗體免疫復合物，在外加磁場磁力作用下帶有磁珠的細胞將停留在磁場中，未帶磁珠的細胞則離開了磁場，從而使細胞分離。

后兩種方法分離的細胞純度較高，但價格昂貴，對細胞的活性影響也較大，甚至導致細胞完全失去活性，目前較少應用。

3 BMSCs體外擴增的微環境

3.1 胎牛血清培養法：胎牛血清是目前干細胞培養中常規應用的添加劑，但其有感染病毒或細菌的潛在風險，此外胎牛血清培養后的細胞含有異體蛋白，并且擴增后也難以清除，Spees等［6］證實應用胎牛血清擴增獲得的108個骨髓間充質干細胞含7～30 mg胎牛血清蛋白，可引起免疫反應。

3.2 自體血清培養法：Mizuno等［7］使用人自體血清代替胎牛血清，實驗也證明自體血清微環境更適合體外培養骨髓間充質干細胞，它能促進BMSCs增殖，縮短傳代時間，維持細胞的穩定，減少細胞自發分化等優點。

3.3 臍血血清培養法：臍血血清含有多種細胞因子，可促進BMSCs的增殖、分化；并且具有采集方便，來源廣泛，對母親及胎兒無影響，巨細胞病毒、EB病毒污染率低，無倫理限制等優勢。Lam等［8］使用自體臍血血清擴增自體臍血干細胞，曠文勇等［9］使用臍帶血血清替代胎牛血清的DMEM/F12培養法，雷曉宇等［10］發現骨髓間充質干細胞在較低體積分數臍血血清中增殖能力良好。這些實驗也都足以說明臍血血清培養法可做為一種安全有效的培養法應用于臨床。

4 BMSCs誘導分化為心肌樣細胞的研究

4.1 誘導分化的方法及相關誘導因素

4.1.1 化學誘導劑：①5-氮胞苷：盡管胞嘧啶類似物5-Aza的誘導作用已獲得肯定，但5-Aza具有細胞毒性則限制了其應用，因此尋找更加安全有效的誘導劑成為當前備受關注的課題之一。②血管緊張素Ⅱ：AngⅡ是一種肽類激素，它可誘導BMSCs向心肌樣細胞分化，其誘導作用可能與濃度，細胞信號轉導通路有關。它同時具有調節代謝，刺激血管平滑肌增殖，調節血管張力的作用。Li等［11］研究證實，AngⅡ刺激BMSCs增殖的作用是通過與受體結合，引發多條信號通路激活使細胞活化，其中最重要的是其激活有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路并發生酪氨酸磷酸化而活化細胞外信號調節激酶（EPK）而產生的。③骨形態發生蛋白-2：BMP-2是轉化生長因子β超家族中的一員，它可調節多種細胞生長、分化和凋亡。王新艷等［12］研究發現，BMP-2介導Smad通路的磷酸化及向細胞核轉位過程，從而在BMSCs向心肌細胞的分化過程中發揮誘導效應。④丁酸鈉：董亮等［13］研究發現組蛋白去乙酰化酶抑制劑丁酸鈉能夠有效誘導骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化，其機制可能與抑制組蛋白去乙酰化酶活性，增強組蛋白的乙酰化，進而激活相關沉默基因，促使其表達有關，因組蛋白乙酰化是誘導骨髓間充質干細胞向心肌樣細胞分化的機制之一。

4.1.2 心肌微環境：①心肌組織裂解液：李琴等［14］用心肌組織裂解液人工模擬心肌生長的微環境，對BMSCs定向誘導。得到的結果證明誘導后的細胞呈明暗交替排列整齊的肌絲樣結構，同時也發現了具有自律性搏動的多核肌管結構。②心肌細胞共培養：Pijnappels等［15］將心肌細胞混合乳鼠BMSCs進行共培養誘導，獲得的細胞有心肌細胞的功能活性，但大齡鼠BMSCs無法得到具有功能活性的心肌細胞。因此可以得出在誘導干細胞分化的過程中不但外部的誘導環境非常重要，同時實驗對象的年齡，細胞的活力和其自身的形態都有關系。

4.2 分化為心肌樣細胞的鑒定方法

4.2.1 形態學鑒定：①在高倍顯微鏡下觀察細胞的形態：如細胞外形是否向心肌樣衍變，細胞是否形成肌管，細胞是否跳動等。②在電子顯微鏡下觀察細胞的超微結構：如定向誘導后的骨髓間充質干細胞是否具有心肌樣細胞的超微結構，如呈梭形樣的細胞，其細胞核位于細胞的中央，胞質內可見糖原顆粒和線粒體結構等。

4.2.2 免疫組化鑒定：①表達心肌細胞的特異性標志：a.結蛋白、α肌動蛋白：作為心肌細胞分化的早期標志物，結蛋白與和α肌動蛋白得到了廣泛的認可。目前用來檢測心肌細胞使用次數最多的特異性指標。b.肌鈣蛋白：具有較高特異性的cTnI，作為心肌損傷的檢測和心肌源性細胞鑒定的特異性生化標志物，其陽性表達說明BMSCs發生心肌轉化白。c.間隙連接蛋白43：Cx43在細胞間電沖動的傳導，維持細胞間電活動和收縮、舒張功能的同步性，心肌功能的保持和細胞間化學信號的交流，都很重要，是心肌閏盤檢測的常用指標。賈敏等［16］在研究BMSCs提取擴增及向心肌細胞誘導的過程中，cTnT和Cx43表達陽性，表明誘導分化的細胞有心肌細胞的特性。d.肌細胞增強子2C：肌細胞增強子2C（MEF2C）作為心臟特異性的因子在心臟發育的過程中均參與、調解心臟特異性基因的表達，MEF2C有顯著的組織特異性。e.超極化激活的核酸環：超極化激活的環核苷酸門控的離子通道（HCN）是編碼起搏電流的離子通道，同時由于HCN和心臟起搏的產生和調節密切相關，因此又被稱作起搏基因。HCN編碼的起搏電流具有超極化激活，對鈉鉀離子均具有通透性，可被細胞內的cAMP調節，具有微弱的單通道電導等獨特特征［17］。HCN的表達在竇房結中依次為HCN4＞HCN2＞HCN1。因此，可以通過檢測HCN4、HCN2和起搏電流判定BMSCs是否分化為心肌細胞。f.肌球蛋白重鏈：已知哺乳動物的心臟表達兩種肌球蛋白重鏈（MHC），即α-MHC和β-MHC。β-MHC蛋白水平能夠在一定程度上反映BMSCs向心肌細胞的分化情況，其基因表達水平是觀察BMSCs向成熟心肌樣細胞分化的重要指標之一。②β半乳糖酐酶基因轉染細胞標記技術：將β半乳糖酐酶基因通過復制缺陷重組胰病毒為載體轉染至待移植培養的骨髓干細胞。通過檢測宿主心臟中的β半乳糖酐酶的活性，即可定性和定位移植干細胞是否分化增殖為心肌細胞。③Y染色體熒光原位雜交技術：運用該技術鑒定移植干細胞的前提是選用雌性動物為受體，同時移植的骨髓干細胞來源于雄性動物，如果雌性受體動物心肌檢測到Y染色體，則可以證明骨髓干細胞已分化增殖為心肌細胞。

4.2.3 電生理學鑒定：目前遇到分化出來的心肌樣細胞的電生理特性的研究尚不多見，雖然一些對細胞的動作電位的特點進行了描述，但對細胞膜上的鈉、鉀、鈣、氯等離子通道的特異性研究在國內外的文獻報道較少。

5 存在的問題及展望

近年來骨髓間充質干細胞因具有易獲得，易增殖，易被誘導分化，不存在道德倫理問題，移植后無免疫排斥反應等優點。它已被作為種子細胞廣泛的應用于骨，軟骨，心肌等組織工程的研究中，并且已經取得了一定的發展。但在一些領域的研究尚處于探索階段，還有如下一些問題需要解決。

5.1 BMSCs的鑒定問題：雖然BMSCs分化為心肌樣細胞的心肌特異性鑒定指標的研究取得一定成果，但仍有許多問題需要解決。如BMSCs表面的多個細胞表面標志物大多缺乏特異性，因此在BMSCs的鑒定方面的仍需進一步的研究。

5.2 BMSCs的誘導問題：BMSCs增殖，分化的控制需要合適的條件，如何既能控制增殖，又可以避免腫瘤細胞形成，同時又能在合適的條件下取得所需的分化途徑，還有待進一步的研究。

5.3 對BMSCs離子通道的研究：從結構蛋白的表達到功能蛋白的表達之間存在著復雜的調控機制，可能與細胞分化的方向和程度密切相關。BMSCs僅表達外向鉀電流，未表達內向的快鈉電流，說明其尚不足以完成心肌細胞的興奮與傳導功能。

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中圖分類號：R54

文獻標識碼：A

文章編號：1671-8194（2016）03-0041-03