氧化苦參堿與奈達鉑聯用對人膠質母細胞瘤U87 MG細胞增殖的影響

郭冰玉，張婷婷，蘇靜緣，王凱文，李曉明

氧化苦參堿與奈達鉑聯用對人膠質母細胞瘤U87 MG細胞增殖的影響

郭冰玉，張婷婷，蘇靜緣，王凱文，李曉明*

[摘要]目的觀察氧化苦參堿與奈達鉑聯用抑制人膠質母細胞瘤U87 MG細胞增殖的效果。方法將傳代的U87 MG細胞分為對照組、奈達鉑單藥處理組(NDP組)、氧化苦參堿單藥處理組(OXY組)和兩種藥物聯合處理組(聯合組)，分別在不同時間點，使用不同濃度的藥物，用MTT方法檢測U87 MG細胞光密度值(OD490)，觀察細胞增殖情況；用流式細胞儀檢測不同處理對各組細胞周期的作用。結果對細胞處理48 h 后，OXY組、NDP組及聯合組U87 MG細胞的增殖抑制率分別為18.74%±2.66%、27.66%±0.87%、75.87%±1.19%。兩種藥物聯合使用對U87 MG細胞的抑制作用顯著高于各單藥組相同劑量藥物對細胞的抑制率，各組抑制率比較差異有統計學意義(P<0.01)。對照組、OXY組、NDP組、聯合組細胞周期G1期的百分比分別為67.81%±0.55%、71.87%±1.64%、78.01%±2.06%、84.75%±0.72%。兩藥聯合應用對細胞G1期的阻滯作用增強，組間比較差異有統計學意義(P<0.01)。結論氧化苦參堿與奈達鉑聯合使用對抑制膠質母細胞瘤細胞增殖有協同效果，可以降低奈達鉑的使用濃度，進而減輕治療時化療藥物的毒副作用。

[關鍵詞]氧化苦參堿；奈達鉑；U87 MG；膠質母細胞瘤

[Abstract]ObjectiveTo observe the effect of oxymatrine combined with nedaplatin on the proliferation of human glioblastoma U87 MG cells.MethodsU87 MG cells were divided into control group,nedaplatin treatment group (NDP group),oxymatrine treatment group (OXY group) and nedaplatin combined with oxymatrine treatment group (combination group).The proliferation rate of U87 MG cells at different time points treated by different concentrations of drugs were tested by MTT and the cells cycle was tested by flow cytometry.ResultsThe inhibition rate of cell proliferation in OXY group,NDP group and combination group were 18.74%±2.66%,27.66%±0.87% and 75.87%±1.19% after 48 h.The inhibition rate in combination group was higher than those of single drug groups,and there were significant differences among the groups (P<0.01).The percentages of cells in G1phase of cell cycle in control group,OXY group,NDP group and combination group were 67.81%±0.55%,71.87%±1.64%,78.01%±2.06% and 84.75%±0.72%.ConclusionOxymatrine combined with nedaplatin has synergistic effects on the inhibition of the proliferation of glioblastoma cells,it can reduce the concentration of and reduce the side effects of nedaplatin.

doi[1]Hiroyuki M,Ogino J,Takahashi A,et al.Rhabd glioblastoma:an aggressive variaty of astrocytic tumor[J].Nagoya J Med Sci,2015,77(1-2):321-328. 10.14053/j.cnki.ppcr.201512003

收稿日期：2015-10-09

基金項目：國家自然科學基金(81171793);盛京自由研究者計劃

通信作者*

Effect of oxymatrine combined with nedaplatin on the proliferation of human glioblastoma U87 MG cellsGUO Bing-yu,ZHANG Ting-ting,SU Jing-yuan,WANG Kai-wen,LI Xiao-ming*(Institute of Neurology,General Hospital of Shenyang Military Command,Shenyang 110016,China)

Key words：Oxymatrine;Nedaplatin;U87 MG;Glioblastoma

0引言

膠質母細胞瘤(Glioblastoma multiforme，GBM)是中樞神經系統中常見的惡性腫瘤，其惡性程度和復發率極高，患者的中位生存期平均為6~14個月[1]。目前常規的治療手段是術后放化療，以提高患者的生存期。但是由于化療藥物本身的毒副作用以及血腦屏障的影響，使得化療對該種腫瘤的治療效果達不到理想的效果[2]。尋找新的藥物及化療方案，減少藥物的毒副作用，對患者的生存質量和生存期具有重要的意義。

氧化苦參堿(Oxymatrine)是苦參的主要有效成分，不僅具有抑制腫瘤的作用[3]，還能夠增強機體免疫力[4]，降低放化療毒副反應[5]。已有研究表明，氧化苦參堿具有開放血腦屏障的作用[6]，并能夠抑制大鼠膠質瘤細胞C6的增殖[7]。順鉑的同類藥物奈達鉑(Nedaplatin)在臨床上已用于多種腫瘤的治療。Takakura等[8]的研究發現，奈達鉑在膠質母細胞瘤的治療上有一定效果。但目前尚未發現有這兩種藥物聯合治療膠質瘤的報道。

本研究以人膠質母細胞瘤U87 MG細胞為研究對象，觀察氧化苦參堿聯合奈達鉑對U87 MG細胞增殖的抑制效果，以及對細胞周期的阻滯作用，為臨床治療膠質瘤提供理論基礎。

1材料與方法

1.1材料與儀器人腦膠質母細胞瘤U87 MG細胞株(實驗室凍存)，DMEM培養基(Invitrogen)，胎牛血清(天津灝洋)，氧化苦參堿(Selleck)，奈達鉑注射液(輝瑞)，四甲基偶氮唑藍(MTT)，PI染料(碧云天)。酶標儀(美國Bio-Rad)，流式細胞儀(美國Bio-Rad)。

1.2細胞培養將U87 MG細胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養基(含50 IU/mL青霉素，50 IU/mL鏈霉素)培養，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養至對數生長期。

1.3藥物處理濃度奈達鉑為臨床常用的化療藥物，根據linburg公式 C=20D [C單位為μg/mL，D為臨床劑量單位mg/(kg·d)]和體表面積計算公式S=1.15+(m-30)×0.1×5-1(其中m>30 kg)計算出MTT所需藥物濃度，奈達鉑設高[10×PPC(Peak plasma concentration)]、中(1×PPC)、低(0.1×PPC) 3個濃度。氧化苦參堿取10、20、40 μg/mL 3個濃度。空白對照組為NaCl處理組。

1.4MTT實驗取對數生長期U87 MG細胞以2×104/mL濃度接種于96孔培養板中，終體積為200 μL，細胞培養12 h貼壁后更換培養基，加入不同濃度藥物，各劑量組及對照組(NaCl處理組)分設3個復孔。處理后的細胞于0、12、24、36、48 h分別加入5 mg/mL MTT溶液10 μL，37 ℃濕潤環境中溫育4 h，棄去孔中的培養基和MTT，在孔中各加入200 μL DMSO，以溶解殘留的MTT-甲臜結晶，置回37 ℃ CO2細胞培養箱中。15 min后，立即在490 nm處記錄吸光值。藥物對細胞的抑制率計算公式：抑制率=1-(劑量組平均OD值/對照組平均OD值)× 100%。

1.5細胞周期分析將對數生長期的U87 MG細胞用胰酶消化后制成1×106/L濃度的細胞懸液，接種于6孔板中，貼壁培養24 h后，加入不同濃度藥物。藥物作用24 h后收集細胞，PBS洗滌后胰酶消化，制成單細胞懸液。用70%的冰乙醇4 ℃固定1 h，用PI染液[配方：0.5 mL PI原液(1 mg/mL)，20 μL RNase (10 mg/mL)，0.1 mL TritonX-100(1%)，20 μL EDTA，加PBS至10 mL，調pH至7.2~7.6]避光染色30 min，用流式細胞儀測定細胞周期。

1.6數據統計分析采用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，計量資料比較使用非配對t檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1不同處理對U87 MG細胞增殖的影響

2.1.1氧化苦參堿組采用不同濃度的氧化苦參堿分別對U87 MG細胞作用0、12、24、36、48 h后，細胞增殖情況見圖1、表1。結果顯示，不同濃度的氧化苦參堿均可以抑制U87 MG細胞的增殖，其細胞增殖抑制率與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，氧化苦參堿對細胞的增殖抑制作用與劑量、作用時間呈正比關系。

2.1.2奈達鉑組采用不同濃度的奈達鉑分別對U87 MG細胞作用0、12、24、36、48 h后，細胞增殖情況見圖2、表2。結果顯示，奈達鉑能夠顯著抑制U87 MG細胞的增殖，增殖抑制率與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)，奈達鉑對細胞的增殖抑制作用與劑量和作用時間呈正比關系。

圖1　不同劑量氧化苦參堿作用下U87 MG細胞的增殖情況

時間(h)NaCl氧化苦參堿(μg/mL)10204000.00-4.55-2.58-2.77120.0011.55**15.84**23.71**240.0013.20**16.73**26.06**360.0015.88**22.75**34.33**480.0019.44**24.93**35.37**

注：與NaCl組比較，**P<0.01

圖2　不同劑量奈達鉑作用下U87 MG細胞的增殖情況

時間(h)NaCl奈達鉑(μg/mL)55050000.003.423.453.45120.0012.10**42.43**54.95**240.0021.40**51.66**62.00**360.0023.50**57.09**66.22**480.0027.66**59.91**68.39**

注：與NaCl組比較，**P<0.01

2.1.3氧化苦參堿與奈達鉑聯合處理組采用各單藥處理組的最低使用濃度聯合處理細胞，見圖3、表3。結果顯示，5 μg/mL奈達鉑與10 μg/mL氧化苦參堿聯合使用對U87 MG細胞增殖的抑制有協同作用，氧化苦參堿能夠顯著提高奈達鉑對U87 MG細胞增殖的抑制作用，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

圖3　奈達鉑、氧化苦參堿單獨使用及聯合應用時細胞的增殖情況

時間(h)NaCl奈達鉑(5μg/mL)氧化苦參堿(10μg/mL)聯合組00.003.423.453.45120.0012.10**6.84**56.93**240.0021.40**9.52**68.79**360.0023.50**15.62**71.69**480.0027.66**18.74**75.87**

注：與NaCl組比較，**P<0.01

2.2不同處理對U87 MG細胞周期的影響見圖4。不同藥物處理時，U87 MG細胞的G1-S期轉化受到了不同程度的抑制，其中兩藥聯合應用時，細胞周期G1-S期被阻滯的程度增強。

3討論

膠質母細胞瘤通常呈浸潤性生長，手術難以徹底清除，患者生存期短，病死率高，5年生存率低于5.5%[9]。術后化療是治療膠質母細胞瘤的重要環節，但是由于血腦屏障和耐藥機制的存在，膠質母細胞瘤的化療效果并不理想[10]。因此，尋找與化療藥物協同作用的藥物以提高治療效果，對提高患者生存率具有積極意義。

本研究顯示，低濃度氧化苦參堿(10 μg/mL)與奈達鉑(0.1×PPC)聯合應用時，對U87 MG細胞增殖的抑制率高于兩者單獨使用的抑制率之和，起到了協同作用的效果。流式分析也顯示當氧化苦參堿與奈達鉑聯合作用24 h時細胞周期G1-S期的阻滯作用增強。推斷氧化苦參堿可以增強奈達鉑對U87 MG細胞增殖的抑制效果。

圖4　不同藥物作用下細胞周期的變化

氧化苦參堿是傳統中藥苦參的主要生物活性成分，具有廣泛的藥理學活性，近年來其抗腫瘤作用受到研究者的關注。已有研究表明，氧化苦參堿聯合環磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)可明顯增強CTX的抗腫瘤效果[11]。對于HNE-1細胞，氧化苦參堿可以增強VCR、平陽霉素、5-FU的化療效果[12]。劉秀均等[13]也通過體內、體外實驗證實，氧化苦參堿與順鉑聯合作用可以顯著提高順鉑對肝癌的抑制率。表明氧化苦參堿具有增強化療藥物敏感性的作用。同時，氧化苦參堿與化療藥物聯合應用，可以降低化療藥物導致的骨髓抑制，緩解化療引起的胃腸道反應，改善患者食欲，減輕疼痛，提高化療耐受性和患者的生存質量[14-15]。Zhang等[16]研究證實，氧化苦參堿可以通過降低血腦屏障的緊密連接，開放血腦屏障，提高化療藥物進入腦組織的比例，因此，氧化苦參堿還可以作為膠質瘤化療的輔助藥物。

綜上所述，氧化苦參堿與奈達鉑聯合應用，可以降低奈達鉑治療膠質母細胞瘤的使用濃度，進而減少奈達鉑化療的毒副作用，對提高膠質瘤的治療效果有一定的意義，是一種極具優勢和潛力的化療輔助藥物。

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作者單位：中國醫科大學附屬盛京醫院a.急診科，b.社會服務部，沈陽 110004