氮氧自由基與γ-氨基丁酸偶聯物的設計合成與抗缺氧活性研究

?

氮氧自由基與γ-氨基丁酸偶聯物的設計合成與抗缺氧活性研究

景臨林，馬慧萍，樊鵬程，何蕾，賈正平

[摘要]目的設計合成一種新型氮氧自由基與γ-氨基丁酸偶聯物并研究其抗缺氧活性。方法以對羥基苯甲醛、溴乙酸乙酯、γ-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽和2,3-二甲基-2,3-二羥氨基丁烷為原料，經醚化、酰胺化、縮合和氧化反應得到一種氮氧自由基與γ-氨基丁酸的偶聯物(化合物3)，并通過小鼠常壓密閉耐缺氧實驗對其抗缺氧活性進行評價。結果3組在常壓密閉缺氧實驗下，與缺氧模型組比較，乙酰唑胺組和化合物3組存活時間均明顯延長，差異有統計學意義(P<0.01)，化合物3組與乙酰唑胺組比較存活時間延長(P<0.01)。與正常對照組比較，缺氧模型組中LD含量顯著升高(P<0.01)，LDH活性顯著降低(P<0.01)；與缺氧模型組比較，化合物3組小鼠血漿中LD含量差異無統計學意義，但是LD累積速率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)。結論氮氧自由基與γ-氨基丁酸偶聯物的設計路線合理，合成方法簡便，產率較高，并且表現出了較高的抗缺氧活性。

[關鍵詞]氮氧自由基；γ-氨基丁酸；設計合成；抗缺氧活性

氮氧自由基(nitronyl nitroxide， NN)是分子結構含未成對自旋單電子的一類穩定的自由基，最初主要作為自旋示蹤劑來說明細胞膜結構和功能[1]。NN是一種特殊的自由基清除劑，通過電子得失和氧化態與還原態之間轉換，能夠以催化的方式大量清除活性氧(ROS)[2]，近年來研究發現，NN具有抗缺血再灌注損傷[3]、抗腫瘤[4]、抗病毒[5]、防輻射[6]和神經保護[7]等眾多生物活性。課題組近期研究還發現，NN對高原缺氧小鼠具有良好的保護作用[8]。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質，可以通過拮抗谷氨酸的興奮性毒性，減輕動物腦缺血時對細胞損傷，有顯著的神經保護作用[9]。有研究發現：GABA能夠減少小鼠耗氧量，延長常壓密閉缺氧小鼠的存活時間，明顯提高小鼠的缺氧耐受性[10]。

為了獲得抗缺氧活性更加優異的化合物，本文根據藥物拼合原理，以對羥基苯甲醛、溴乙酸乙酯、γ-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽和2,3-二甲基-2,3-二羥氨基丁烷為原料，將具有抗缺氧活性的γ-氨基丁酸與氮氧自由基分子通過酰胺鍵連接，合成了一種新型氮氧自由基與GABA偶聯物，產物結構經IR、EPR、EI-MS和元素分析確認，并觀察其抗缺氧活性。

1材料與方法

1.1藥品與試劑γ-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽、N-甲基嗎啉和溴乙酸乙酯(阿拉丁試劑公司)；對羥基苯甲醛(南京多博化工有限公司)；GF254高效板和柱層析硅膠(青島海洋化工廠分廠)；乙酰唑胺(武漢遠城科技發展有限公司，批號100114，純度>99%)；乳酸(LD)測試盒和乳酸脫氫酶(LDH)測試盒(南京建成生物工程研究所)；其他均為市售分析純試劑。無水的溶劑經除水處理。

1.2實驗動物清潔級BABL/C雄性小鼠24只，體重18～22 g，由蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科提供，許可證號：SYXK(軍)2014-0029。

1.3實驗儀器DHJF-2005低溫反應器(鄭州長城科工貿有限公司)；NEXUS 670紅外光譜儀(KBr壓片，美國Thermo Nicolet公司)；Bruker AVANCE III 400核磁共振波譜儀(瑞士Brucker公司，以CDCl3或者DMSO-d6為溶劑，TMS為內標，美國Sigma公司)；Vario EL cube型元素分析儀(德國Elementar公司)；LCMS-API 3200質譜儀(美國Applied Biosystems公司)；ER200DSRC10/12電子順磁共振波譜儀(瑞士Brucker公司)。

1.4實驗方法

1.4.12,3-二甲基-2,3-二羥氨基丁烷按照文獻[11]方法制備：合成路線見圖1。

圖1　2,3-二甲基-2,3-二羥氨基丁烷的合成路線

1.4.22-(4-甲酰基苯氧基)乙酸(化合物1)：將1.22 g(10 mmol)對羥基苯甲醛、2.07 g(15 mmol)K2CO3懸浮于100 ml無水丙酮中，攪拌下滴加溴乙酸乙酯3.2 ml。滴畢后升溫至60℃，繼續反應6 h，TLC檢測反應，反應結束后，過濾，減壓除去丙酮，殘余物溶于50 ml甲醇中，冷卻至0℃，加入1.5 g KOH，繼續攪拌1 h，減壓除去甲醇，殘余物溶于50 ml水中，用2 mol/L鹽酸調節pH=6，此時有大量白色固體析出，過濾，濾餅用冰水洗滌數次，真空干燥后的目標化合物1。

1.4.34-(2-(4-甲酰基苯氧基)乙酰氨基)丁酸甲酯(化合物2)：將化合物1(0.91 g，5 mmol)和4-氨基丁酸甲酯鹽酸鹽(0.92 g，6 mmol)溶于50 ml無水四氫呋喃中，冷卻至0℃，用N-甲基嗎啉調節pH=9。緩慢滴加溶于20 ml無水THF的DCC(1.22 g，6 mmol)，滴畢后0℃繼續攪拌2 h，然后升至室溫繼續反應16 h，TLC監測反應完全后，過濾，減壓除去溶劑后快速柱層析分離，得目標化合物2。

1.4.42-(4-(2-((4-甲氧基-4-丁甲酰基)氨基)-2-氧代乙氧基)苯基)-4,4,5,5-四甲基-咪唑啉-3-氧-1-氧基自由基(化合物3)：將化合物2(1.39 g，5 mmol)和0.74 g(5.0 mmol)2,3-二甲基-2,3-二羥氨基丁烷溶于25 ml甲醇中，回流反應12~15 h。減壓除去甲醇，殘余物懸浮于25.0 ml CH2Cl2中，低溫反應器冷卻至0℃，加入15.0 ml NaIO4(0.85 g)水溶液，劇烈攪拌15 min后停止反應。靜置分層后，水相用CH2Cl2萃取兩次，合并有機相，無水Na2SO4干燥過夜，過濾，減壓除去溶劑，快速柱層析分離，得藍色油狀物，為目標化合物3。合成線路見圖2。

圖2　氮氧自由基與γ-氨基丁酸偶聯物的合成路線

1.4.5常壓密閉缺氧實驗：取清潔級BABL/C雄性小鼠24只，隨機分成4組，每組6只。分為正常對照組、缺氧組、乙酰唑胺組和化合物3組。正常對照組不給藥，不缺氧；缺氧組腹腔注射(ip)等容積生理鹽水加上適量Tween 80；乙酰唑胺組ip乙酰唑胺200 mg/kg；化合物3組ip化合物3為200 mg/kg。給藥 30 min后，除正常組外，將其余3組小鼠放入250 ml廣口瓶(瓶內放堿石灰15 g以吸收CO2和H2O，墊濾紙以吸收尿液，廣口瓶用前均盛水校正容量)中，每瓶1只小鼠，加蓋密封，以呼吸停止為指征，記錄小鼠的存活時間。小鼠死亡后即刻取出，從心臟抽出約0.5 ml血漿并注入含3%枸櫞酸鈉的離心管中，3500 r/min離心5 min，收集上清并按照試劑盒說明書測定乳酸(LD)含量和乳酸脫氫酶(LDH)活力。

2結果

2.1化合物結構表征

2.1.1化合物1：白色粉末1.62 g，產率90%。ESI-MS(m/z)：181[M+H]+。1H-NMR(DMSO-d6，400 MHz) δ：13.16(s，1 H)，9.89(s，1 H)，7.88(t，2 H)，7.15(t，2 H)，4.9(s，2 H)。13C-NMR(DMSO-d6，100 MHz)δ：190.6，169.7，162.7，131.8，131.6，130.0，115.0，64.6。

2.1.2化合物2：白色粉末1.00 g，產率72%。ESI-MS(m/z)：280 [M+H]+。1H-NMR(CDCl3，400 MHz)δ：9.92(s，1 H)，7.89(d，J=8.4 Hz，2 H)，7.07(d，J=8.4 Hz，2 H)，6.92(s，1 H)，4.58(s，2 H)，3.68(s，3 H)，3.40~3.45(m，2 H)，2.40 (t，2 H)，1.88~1.95(m，2 H)。13C-NMR(CDCl3，100 MHz)δ：190.35，173.66，167.2，161.7，132.1，130.9，114.9，67.1，51.9，38.6，31.3，24.30。

2.1.3化合物3：藍色油狀物1.11 g，產率55%。ESI-MS(m/z)：407 [M+H]+。IR(KBr)：3365，2992，1735，1670，1604，1536，1360，1299，1258，1188，1046，836 cm-1。EPR(CH3OH)：五重峰，g=2.0068，|aN|=7.74 G。Anal. Calcd for C20H28N3O6：C 59.10，H 6.94，N 10.34； Found：C 58.88，H 7.23，N 10.72。

2.2常壓密閉缺氧實驗3組在常壓密閉缺氧實驗下存活時間分別為：缺氧模型組(33.43±3.12)min、乙酰唑胺組(38.12±2.17)min、化合物3組(44.34±4.25)min。與缺氧模型組比較，乙酰唑胺組和化合物3組存活時間均明顯延長，差異有統計學意義(P<0.01)，化合物3組與乙酰唑胺組比較存活時間延長(P<0.01)。

與正常對照組比較，缺氧模型組中LD含量顯著升高(P<0.01)，LDH活性顯著降低(P<0.01)；與缺氧模型組比較，化合物3組小鼠血漿中LD含量無顯著性差異，但是LD累積速率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，同時，LDH活性顯著升高，并接近正常小鼠。見表1。

表1　4組小鼠血漿中LD含量、LD累計速率和LDH活性的比較±s)

3討論

3.1分子設計課題組前期研究發現，NN作為一種新型自由基清除劑，能夠明顯延長常壓密閉缺氧小鼠的存活時間，降低高原缺氧小鼠心腦組織中自由基水平，提高抗氧化酶的活力，具有明顯的保護作用[11]。缺氧條件下，腦組織中神經遞質代謝會出現紊亂，導致興奮性氨基酸過量釋放，從而對神經細胞產生毒性作用。GABA是中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質，可通過突觸后膜超極化減少離子內流，降低細胞代謝及氧消耗量，使突觸后神經元處于保護性抑制狀態，從而對缺氧導致的神經損傷具有明顯的保護作用[12]。通過將兩種作用機制不同分子結合，從而得到一種雙靶標化合物，能夠提高生物活性，減少用量，降低毒副作用。基于以上考慮，本文將GABA分子引入到氮氧自由基結構中，以期得到抗缺氧活性更加優異的化合物。

3.2合成方法以醛和2,3-二甲基-2,3-二羥氨基丁烷為原料，通過縮合和氧化反應是獲得咪唑啉類NN的唯一方法，其中氧化過程是該方法的關鍵步驟。最初使用二氧化鉛為氧化劑，反應為非均相體系中，同時體系呈黑色，難以監測反應進程，造成氧化劑用量大、反應時間較長、產率較低，經過改進后，使用易溶于水的高碘酸鈉為氧化劑，縮短了反應時間，提高了產率。在氧化反應過程中，過氧化是最主要的副反應，通過對反應條件的摸索，利用縮合產物難溶于有機溶劑而NN易溶于CH2Cl2的性質，使用二氯甲烷和水的混合溶劑，將生成自由基產物及時萃取到CH2Cl2中，減少與高碘酸鈉的接觸，同時采取降低反應溫度，嚴格控制氧化劑的用量和反應時間等措施，最大限度的減少過氧化產物的生成，以較高的產率得到了目標化合物3。

3.3結構表征在化合物1的1H-NMR譜和13C-NMR中，δ:13.16和190.6分別為羧基中氫和羰基碳的質子信號，同時δ:4.9出現亞甲基質子信號，表明分子結構包含了-CH2COOH結構。質譜檢測分子量與目標化合物一致。

化合物2的1H-NMR譜中，δ:6.92為仲胺基質子信號，-OMe 在δ:3.68處為一個尖銳的單峰，同時羧基中氫質子信號消失，從13C-NMR中可以看出，δ:190.35和173.66分別為酰胺和酯基中羰基碳質子信號，同時結構中增加了三個亞甲基和一個甲氧基質子信號，表明4-氨基丁酸甲酯已經成功引入化合物1中。

由于NN在核磁中無信號，因此無法通過NMR對其結構進行表征，在化合物3的紅外譜圖中，酰胺鍵中N-H的伸縮振動出現在3365 cm-1，1650和1735 cm-1的分別為酰胺和酯基中羰基的特征吸收峰，1360 cm-1出現典型N-O鍵吸收峰；1208和1604 cm-1出現C-N和C=N鍵特征吸收峰，836 cm-1為苯環1,4-取代特征峰；電子順磁共振(electron paramagnetic resonance， EPR)是觀察和檢測自由基等順磁性物質的一種最直接、最有效的方法，是檢測和識別自由基不可缺少的工具[13]。以無水甲醇為溶劑，化合物3的EPR譜呈現對稱的五重峰，各峰強度比為1∶2∶3∶2∶1，表明分子存在單電子自由基結構，見圖3。化合物3的質譜和元素分析結果與其分子量和分子式一致。

3.4抗缺氧活性研究常壓密閉缺氧為非特異性缺氧[14]，最終會造成小鼠窒息死亡，存活時間的長短可以反映藥物的抗缺氧作用。通過該模型對所合成的目標化合物3進行活性評價，結果表明：與缺氧模型組相比，化合物3能延長常壓密閉小鼠的存活時間，且活性優于乙酰唑胺組。

圖3　化合物3的電子順磁共振譜

LD是糖酵解的代謝產物，其含量的變化可以反映機體損傷的程度[15]。結果顯示：缺氧模型組較正常對照組LD含量顯著升高，雖然化合物3組LD含量較缺氧組無顯著變化，但是其LD累積速率明顯降低，表明化合物3雖然不能避免缺氧小鼠出現酸中毒，但是可以延緩其出現的時間。LDH是一種糖酵解酶，存在于機體所有組織細胞的胞質內，能夠催化丙酮酸和乳酸相互轉變，其水平變化可以反映對機體乳酸代謝的情況[16]。缺氧導致LDH活力顯著下降，化合物3能夠維持缺氧小鼠中LDH活力，緩解缺氧導致的乳酸蓄積。

綜上所述，本文將NN與GABA通過酰胺鍵相連，合成了一種新型偶聯物，采取的合成路線短、方法簡單，條件溫和，產物結構經IR、EPR、EI-MS和元素分析與目標化合物一致，并通過常壓密閉缺氧實驗對其活性進行評價，結果表明化合物3具有明顯的抗缺氧作用。

[參考文獻]

[1]Harbour J R, Bolton J R. Superoxide formation in spinach chloroplasts: electron spin resonance detection by spin trapping[J].Biochem Biophys Res Commun, 1975,64(3):803-807.

[2]Augusto O, Trindade D F, Linares E,etal. Cyclic nitroxides inhibit the toxicity of nitric oxide-derived oxidants: mechanisms and implications[J].An Acad Bras Cienc, 2008,80(1):179-189.

[3]Bi W, Wang F, Bi Y,etal. Renal ischemia/reperfusion injury in rats is attenuated by a synthetic glycine derivative[J].Eur J Pharmacol, 2009,616(1-3):256-264.

[4]Guo J, Zhang Y, Zhang J,etal. Anticancer effect of tert-butyl-2(4,5-dihydrogen-4,4,5,5-tetramethyl-3-O-1H- imidazole-3-cationic-1-oxyl-2)-pyrrolidine-1-carboxylic ester on human hepatoma HepG2 cell line[J].Chemico-Biological Interactions, 2012,199(1):38-48.

[5]Wang H, Gao P, Jing L,etal. The heart-protective mechanism of nitronyl nitroxide radicals on murine viral myocarditis induced by CVB3[J].Biochimie, 2012,94(9):1951-1959.

[6]Wang H, Jia Y, Gao P,etal. Synthesis, radioprotective activity and pharmacokinetics characteristic of a new stable nitronyl nitroxyl radical-NIT2011[J].Biochimie, 2013,95(8):1574-1581.

[7]Shi T Y, Zhao D Q, Wang H B,etal. A new chiral pyrrolyl alpha-nitronyl nitroxide radical attenuates beta-amyloid deposition and rescues memory deficits in a mouse model of Alzheimer disease[J].Neurotherapeutics, 2013,10(2):340-353.

[8]Fan P C, Ma H P, Jing L L,etal. The antioxidative effect of a novel free radical scavenger 4'-hydroxyl-2-substituted phenylnitronyl nitroxide in acute high-altitude hypoxia mice[J].Biol Pharm Bull, 2013,36(6):917-924.

[9]姚揚,楊洋,張濤，等.γ-氨基丁酸治療腦缺血的研究進展[J].繼續醫學教育,2005,19(12):59-63.

[10]魏智清,談永萍.γ-氨基丁酸對小鼠缺氧耐受性的影響[J].江蘇農業科學,2012,40(7):297-298.

[11]景臨林.新型氮氧自由基的設計合成及其性能研究[D].西安：第四軍醫大學，2010，38-39.

[12]張勇.γ-氨基丁酸與腦缺血損傷[J].卒中與神經疾病,1999,S1:30-32.

[13]蔡余,王永健, 王健，等.抗氧化劑活性的電子順磁共振(EPR)研究[J].化學進展,2011,23(9):1659-1671.

[14]鄭悅，嵇揚.抗缺氧研究常用動物模型及抗缺氧藥物[J].解放軍藥學學報.2012,26(2):170-173.

[15]Haworth J C, Robinson B H, Perry T L. Lactic acidosis due to pyruvate carboxylase deficiency[J].J Inherit Metab Dis, 1981,4(2):57-58.

[16]Chang Q, Miao X, Ju X,etal. Effects of pulse current on endurance exercise and its anti-fatigue properties in the hepatic tissue of trained rats[J].PLoS One, 2013,8(10):75093.

(收稿時間：2015-09-22修回時間：2015-10-25)

缺氧與抗氧化研究專題

·論著·

A Study on Design, Synthesis and Anti-hypoxia Activity of Nitronyl Nitroxide-γ-aminobutyric Acid Conjugate

JING Lin-lin, MA Hui-ping, FAN Peng-cheng, HE Lei, JIA Zheng-ping (Key Laboratory of Prevention and Cure for the Plateau Environmental Damage of PLA, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, lanzhou 730050, China)

[Abstract]ObjectiveTo design the synthesis of a nitronyl nitroxide-γ-aminobutyric acid conjugate and to investigate its anti-hypoxia activity. MethodsA nitronyl nitroxide-γ-aminobutyric acid conjugate (compound 3) was achieved via etherification, amidation, condensation and oxidizing reaction using 4-hydroxybenzaldehyde, ethyl bromoacetate， methyl 4-aminobutyrate hydrochloride and 2, 3-dimethyl-2, 3-dihydroxylamino butane as starting materials. The anti-hypoxic activities of the compound were evaluated using the normobaric hypoxia experiment of mice. ResultsCompared with those in the hypoxia model group, Acetazolamide and compound 3 groups had significantly prolonged survival time in the three groups under normobaric hypoxia experiment, and the differences were statistically significant (P<0.01). The survival time of mice in compound 3 group was significantly longer than that in Acetazolamide group (P<0.01). Compared with those in the normal control group, the lactic acid (LD) content was significantly increased, while the l-lactate dehydrogenase (LDH) activity was significantly decreased in compound 3 group (P<0.01). Compared with those in the hypoxia model group, the LD content had no significant changes, but the LD accumulation rate was significantly decreased in compound 3 group (P<0.01). ConclusionThe synthetic route of the nitronyl nitroxide-γ-aminobutyric acid conjugate is rational and simple with high yield, and it exhibits excellent anti-hypoxic activity.

[Key words]Nitronyl nitroxide; γ-aminobutyric acid; Design and synthesis; Anti-hypoxia activity

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.001

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R34A

[文章編號]2095-140X(2015)12-0001-04

[通訊作者]賈正平，E-mail：1026573411@qq.com

[基金項目][作者單位]730050 蘭州，蘭州軍區蘭州總醫院藥劑科全軍高原損傷防治重點實驗室