血管內皮生長因子在急性減壓缺氧小鼠肺組織中的表達研究

任　俊，馬慧萍，高榮敏，吳金華，蒙　萍，賈正平

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血管內皮生長因子在急性減壓缺氧小鼠肺組織中的表達研究

任俊，馬慧萍，高榮敏，吳金華，蒙萍，賈正平

[摘要]目的研究血管內皮生長因子(vascuar endpthelial growth factor，VEGF)在急性減壓缺氧小鼠肺組織中的表達及意義。方法采用低壓低氧動物實驗艙分別模擬海拔6000 m和8000 m高原缺氧環境，將BALB/c小鼠隨機分為正常對照組、缺氧6、9、12、24、48、72 h組，每組10只。HE染色切片觀察缺氧不同時間小鼠肺組織病理學的改變情況，免疫組織化學法檢測肺組織VEGF的表達水平差異及其規律。結果缺氧各組肺組織肺泡間質薄厚不均，肺泡大小不一，部分肺泡腔內見少量紅細胞，血管擴張充血出血，且隨海拔的增加病理性狀況愈嚴重；VEGF陽性表達強度半定量評分較正常對照組顯著增加(P<0.01)，且隨海拔的增加及缺氧時間的延長表達增加。結論減壓缺氧能造成小鼠肺組織損傷，呈現水腫病理表現，并刺激VEGF分泌，最終加重肺水腫和誘導細胞壞死。

[關鍵詞]血管內皮生長因子；減壓缺氧；急性高原病；肺組織

缺氧是許多疾病的一個基本病理過程，與包括急性高原病在內的心血管疾病、中風等多種疾病的發生有關。高原缺氧是引起高原肺水腫的重要因素，有研究報道，在進入海拔3700 m以上高原的人群中，高原肺水腫的發病率為0.5%～2%。高原肺水腫起病急、進展快、危害大，主要是因高原缺氧引起機體肺動脈壓增高、肺血容量增加、肺微循環障礙，進而導致液體滲漏至肺間質和肺泡而引起的一種高原特發病。近年來有學者研究發現，血管內皮細胞生長因子(vascuar endpthelial growth factor，VEGF)不但能促進血管內皮細胞的生成，而且在缺氧性肺水腫形成機制中起重要作用，這些相關研究成為近年來醫學研究的熱點之一[1]。課題組前期研究表明急性減壓缺氧能使小鼠腦、心組織中VEGF表達升高，且隨著缺氧時間的延長，其表達明顯增加，從而導致血管通透性增加，組織損傷也愈加明顯[2]。本實驗擬采用低壓低氧動物實驗艙建立模擬急性高原缺氧小鼠模型，觀察肺組織的組織病理狀態，并采用免疫組化方法檢測損傷肺組織中VEGF蛋白的表達，探討急性高原缺氧損傷后VEGF蛋白在肺組織中的變化情況。

1材料與方法

1.1實驗動物SPF級雄性Balb/c小鼠130只，體重18~22 g，購自蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科，許可證編號：SYXK(軍)2012-0020，飼養于蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科。所有實驗動物給予充足、潔凈的飲水和食物，置于12 h晝夜循環的恒溫(23℃)環境中。所有對于實驗動物的操作符合相關倫理要求，已最大限度的保障實驗動物的福利，避免非必要的損傷性處理。

1.2儀器與試劑FLYDWC50-IIA型低壓低氧動物實驗艙(中航工業貴州雷航空軍械有限責任公司)；倒置顯微鏡(奧林巴斯)；高速離心機(德國Appendorf公司)；水浴鍋(上海醫療器械七廠)；隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械廠)；TB-718E型生物組織自動包埋機(湖北泰雅電子技術有限公司)；冷凍切片機、ZT-12J1生物組織自動脫水機、生物組織攤烤片機(購于湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司)；多克隆抗體Rabbit polyclonalto VEGF(購于Abcam)；抗體稀釋液、SABC免疫組化試劑盒(包括二抗)、DAB顯色液(購于武漢博士得生物工程有限公司)；PBS磷酸鹽緩沖液，檸檬酸鹽緩沖液(購于北京中山金橋生物技術有限公司)；所用化學試劑均為分析純。

1.3方法

1.3.1模擬海拔6000 m和8000 m急性高原缺氧小鼠實驗：取SPF級健康雄性BALB/c小鼠130只，飼養適應3 d后按照6000 m和8000 m兩種缺氧環境隨機分成正常對照組，缺氧6、9、12、24、48、72 h組，每組10只。正常對照組小鼠不缺氧，分別將其余各組小鼠放入低壓低氧動物實驗艙模擬6000 m和8000 m海拔缺氧環境。缺氧時以10 m/s的速度升至6000 m或8000 m海拔，維持相應缺氧時間，完成缺氧后于10 min內快速下降海拔高度使艙內氣壓與外界大氣壓相同。小鼠完成缺氧處理后立即頸椎脫臼致死，并根據不同實驗目的對肺組織進行相應處理。

1.3.2肺組織病理觀察：各組小鼠完成缺氧處理后，取出各組小鼠的肺組織，以生理鹽水洗凈血液，立即浸入10%甲醛中固定。各個樣本進行石蠟包埋、組織切片、染色等相應的處理，最終用顯微鏡觀察。

1.3.3肺組織VEGF的表達：免疫組織化學處理步驟如下：①取各組肺組織標本的石蠟切片放至烘箱；②脫蠟；③加入3% H2O2滅活內源性酶；④95℃高溫修復抗原；⑤加入BSA封閉液；⑥加入一抗：一抗稀釋比例1︰150；⑦加入二抗；⑧加入SABC；⑨DAB顯色，控制反應時間；⑩蘇木素復染；封片。每張切片隨機選取3個200倍高倍視野，背景為紫藍色，參照Harsha等[1]標準，對VEGF陽性表達強度行半定量評分：細胞未著色為0分，散在細胞著色(淺黃色)為1分，彌漫性弱陽性著色(淺棕黃色)為2分，彌漫性中等強度著色(棕黃色)為3分，彌漫性強陽性著色(棕褐色)為4分。

2結果

2.1模擬海拔6000 m高原缺氧小鼠肺組織顯微結構觀察如圖1所示，光鏡下正常對照組肺泡結構正常，肺泡腔大小一致，肺泡間質清晰；與正常對照組相比，模擬海拔6000 m缺氧6 h組小鼠肺泡間質薄厚不均，肺泡大小不一；缺氧9 h組和12 h組小鼠肺泡間質增厚，部分肺泡腔內見少量紅細胞，血管充血；缺氧24 h組較12 h組小鼠損傷嚴重，且部分肺泡腔見少許滲出液；缺氧48 h和72 h組小鼠肺間質增厚，肺泡結構不清晰，血管充血出血，肺泡腔內見紅細胞及少量含鐵血黃素，部分肺泡擴張。

2.2模擬海拔6000 m高原缺氧小鼠肺組織VEGF蛋白的表達VEGF在胞漿表達，陽性胞核呈藍色，胞漿著棕黃色，顏色深淺和著色強弱表明VEGF表達水平的高低。如圖2、圖5所示，與正常對照組相比，模擬海拔6000 m各缺氧組小鼠肺組織胞漿著色深，著色面積增大，即VEGF表達明顯增加，且隨著缺氧時間的延長，VEGF表達增加更為顯著。

2.3模擬海拔8000 m高原缺氧小鼠肺組織顯微結構觀察如圖3所示，光鏡下正常對照組小鼠肺泡結構正常，肺泡間質薄厚均勻清晰可見；與正常對照組相比，模擬海拔8000 m缺氧6 h組小鼠肺泡間質增厚，薄厚不均，肺泡腔大小不一；缺氧9 h組較6 h組小鼠損傷稍重，部分血管擴張充血；缺氧12 h組小鼠血管明顯擴張充血出血，肺泡大小不一，部分肺泡腔內見較多紅細胞及少量滲出液；缺氧24 h組較12 h組小鼠損傷稍緩和；缺氧48 h組和72 h組較24 h組小鼠病理變化顯著，血管明顯擴張充血出血，肺泡腔內見較多紅細胞及大量滲出液。實驗結果顯示，模擬海拔8000 m高原缺氧環境對小鼠肺組織的損傷較海拔6000 m嚴重。尤其在缺氧12 h組和缺氧更長時間的小鼠中，這種損傷程度更加嚴重的趨勢愈明顯，壞死的細胞越來越多，組織結構被破壞得越來越嚴重。

圖1　模擬海拔6000 m高原缺氧不同時間對小鼠肺組織顯微結構的影響(HE×200)A.正常對照組;B.缺氧6 h組;C.缺氧9 h組;D.缺氧12 h組;E.缺氧24 h組;F缺氧48 h組;G.缺氧72 h組

圖2　模擬海拔6000 m高原缺氧不同時間對小鼠肺組織血管內皮生長因子表達的影響(HE ×200)A.正常對照組;B.缺氧6 h組;C.缺氧9 h組;D.缺氧12 h組;E.缺氧24 h組;F缺氧48 h組;G.缺氧72 h組

圖3　模擬海拔8000 m高原缺氧不同時間對小鼠肺組織顯微結構的影響(HE ×200)A.正常對照組;B.缺氧6 h組;C.缺氧9 h組;D.缺氧12 h組;E.缺氧24 h組;F缺氧48 h組;G.缺氧72 h組

2.4模擬海拔8000 m高原缺氧小鼠肺組織VEGF蛋白的表達如圖4、圖5所示，與正常對照組相比，模擬海拔8000 m各缺氧組小鼠肺組織胞漿著色深，著色面積增大，即VEGF表達明顯增加，且在9 h段表達顯著增加，此后隨時間延長，VEGF表達增加顯著。實驗結果顯示，小鼠在模擬海拔8000 m缺氧條件下，為了應對比模擬海拔6000 m更為嚴重的缺氧環境，顯著增加了VEGF的表達，進而加重肺部細胞所受到的損傷，導致細胞凋亡，肺泡破損。

圖4　模擬海拔8000 m高原缺氧不同時間對小鼠肺組織血管內皮生長因子表達的影響(HE ×200)A.正常對照組;B.缺氧6 h組;C.缺氧9 h組;D.缺氧12 h組;E.缺氧24 h組;F缺氧48 h組;G.缺氧72 h組

圖5　模擬海拔6000 m與8000 m高原缺氧不同時間對小鼠肺組織血管內皮生長因子表達的影響注：與正常對照組相比，aP<0.05，bP<0.01

3討論

高原缺氧是引起高原肺水腫的重要因素。機體缺氧后，為了代償需要，血管容易增生，而VEGF是促血管增生、增加血管通透性的關鍵因子[2]。本實驗通過模擬高原急性缺氧環境，研究肺組織的形態學方面的變化，并從蛋白水平研究VEGF的變化情況。

模擬高原缺氧小鼠肺組織病理學研究發現，光鏡下正常對照組小鼠肺泡結構正常，肺泡腔大小一致，肺泡間質清晰；海拔6000 m小鼠隨著缺氧時間的延長損傷程度逐漸加重：6 h組肺泡間質薄厚不均，肺泡大小不一； 9 h和12 h組肺泡間質增厚，部分肺泡腔內見少量紅細胞，血管充血；24 h組較12 h組嚴重且部分肺泡腔見少許滲出液；48 h和72 h組肺間質增厚，肺泡結構不清晰，血管充血出血，肺泡腔內見紅細胞及少量含鐵血黃素，部分肺泡擴張；海拔8000 m小鼠在相同缺氧時間點較6000 m小鼠的損傷程度更為明顯，其中24 h組雖較12 h組稍緩和，但48 h組和72 h組水腫情況更為嚴重，這可能是由于在較高海拔下機體代償性反應加重所致，具體原因有待進一步研究。本實驗結果表明，缺氧會造成小鼠肺組織呈現病理性損傷，有水腫現象，且損傷程度與海拔高度及缺氧時間有關。

VEGF是血管新生和生成調節最關鍵的調節因子，可以強有力的促進新生血管形成，在創傷愈合、慢性炎癥時的血管增生、腫瘤血管的形成等過程中發揮重要作用[3-5]。然而，作為一種促炎癥因子，VEGF能夠增加血管通透性[6-8]。低氧誘導VEGF生成，當機體內VEGF的水平達到一定濃度時，VEGF作用于血管內皮細胞，導致血管滲漏，促進急性高原病的惡化[9-11]。本實驗結果表明，缺氧能造成小鼠肺組織損傷，呈現水腫病理表現，并刺激VEGF分泌，激發新生血管形成。缺氧后，肺組織中VEGF的表達升高，且隨模擬海拔的增高及缺氧時間的延長，表達顯著增加。VEGF是通過與受體的靶向結合發揮調控血管生成等功能的[12-13]。受體VEGFR-2參與調節血管內皮功能[14-15]，該受體被VEGF激活后，作用于酪氨酸激酶傳導通路，誘導血管新生，促進血管內皮細胞有絲分裂[16-17]。同時，VEGF增強囊泡器的功能，提高血管通透性，從而增加纖維蛋白原等物質外滲，導致血漿滲透壓降低，引起組織水腫[18-19]。

高原肺水腫是一種非心源性的肺水腫，發生在急進海拔3000 m以上的健康人群中，缺氧性肺血管擴張造成的滲漏是其發病的主要原因。VEGF對于缺氧機體來說具有雙刃劍的作用，一方面，VEGF增加有利于缺氧狀態下機體的代償；另一方面，VEGF能影響血管內皮細胞，其表達增加會導致血管通透性增加，血漿外滲，導致組織呈現水腫病理性變化。VEGF適量升高，誘發新血管形成而不會引起心腦肺等器官的病理變化，有利于提高機體對高原缺氧的適應能力。因此，我們將對VEGF進行深入研究，篩選作用于VEGF的有效藥物，通過調控VEGF，使其適量表達，從而應用于治療高原肺水腫、急性高原病等疾病。

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(收稿時間：2015-09-10修回時間：2015-10-20)

腫瘤基礎與臨床

·論著·

VEGF Expression on Lung Tissues of Mice under Acute Depression and Hypoxia Condition

REN Jun, MA Hui-ping, GAO Rong-min, WU Jin-hua, MENG Ping, JIA Zheng-ping (Key Laboratory of Prevention and Cure for the Plateau Environmental Damage of PLA, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the expression and significance of vascular endothelial growth factor (VEGF) in lung tissues of mice under acute depression and hypoxia condition. MethodsThe hypobaric and mionectic chamber was used to simulate 6000 m and 8000 m high altitude hypoxia environment, and BALB/c mice were randomly divided into normal group (n=10), hypoxia for 6 h, 9 h, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h groups (n=10 for each group). The pathological changes of lung tissues in different hypoxia times were observed using HE staining, and VEGF expressions and its rule of lung tissues were detected using immunohistochemistry method. ResultsIn hypoxia groups, the tissues between pulmonary alveoli were different thickness and sizes, and a small amount of red blood cells was observed in some pulmonary alveoli. The vascular extension, hyperemia and hemorrhage were found, and pathological changes were more serious with increasing altitude. Compared with those in normal group, the positive VEGF expression of intensity semi-quantitative scores were significantly increased in hypoxia groups (P<0.01), and VEGF expressions were increased with increasing altitude and prolonged hypoxia time. ConclusionThe lung tissues may be damaged in mice under depression and hypoxia condition, and it can induce edema and stimulate VEGF secretion, which may result in more serious pulmonary edema and cell death.

[Key words]Vascular endothelial growth factor； Depression and hypoxia； Acute mountain sickness； Lung tissues

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.002

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R341 R977.6A

[文章編號]2095-140X(2015)12-0005-05

[通訊作者]馬慧萍，E-mail：mahuipingcxr@yahoo.com

[基金項目][作者單位]730050 蘭州，蘭州軍區蘭州總醫院藥劑科全軍高原環境損傷防治重點實驗室