白楊素對大鼠急慢性腦缺血損傷后氧化應激和Nrf2/HO-1途徑的影響

馬慧萍，吳金華，蒙　萍，王　寧，漆欣柱，何　蕾，賈正平

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白楊素對大鼠急慢性腦缺血損傷后氧化應激和Nrf2/HO-1途徑的影響

馬慧萍，吳金華，蒙萍，王寧，漆欣柱，何蕾，賈正平

[摘要]目的探討白楊素(chrysin)對大鼠急、慢性腦缺血損傷的防治作用機制。方法采用線栓法建立SD大鼠急性大腦中動脈梗阻模型，采用改良的雙側頸總動脈結扎法建立SD大鼠慢性大腦低灌注模型，通過神經功能學評分、TTC染色、HE染色評價損傷情況，通過測定生化指標和蛋白免疫印跡法揭示其作用機制。結果大腦中動脈阻塞模型(MCAO)組相對于大腦中動脈阻塞模型假手術(Sham-MCAO)組，神經功能學評分、梗死體積顯著增加(P<0.01);總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活力顯著下降(P<0.05或P<0.01)；核因子E2相關因子(Nrf2)和血紅素加氧酶(HO-1)的表達有所上調，給予白楊素后，損傷情況得到改善，Nrf2和HO-1的表達顯著上調(P<0.05或P<0.01)；慢性大腦低灌注模型假手術(Sham-CCH)組、慢性大腦低灌注模型(CCH)組和慢性大腦低灌注模型白楊素給藥(CCH+Chrysin)組與急性大腦中動脈梗阻相關實驗組的結果類似。結論Chrysin通過上調Nrf2，激活Nrf2-ARE通路，減輕了急慢性腦缺血的損傷。

[關鍵詞]腦缺血；白楊素；急性大腦中動脈梗阻；慢性大腦低灌注；Nrf2-ARE通路

腦缺血類疾病是一類嚴重損害人類健康的疾病。由于其高致死率、高致殘率、缺乏有效藥物的特征，社會危害性十分巨大。腦缺血類疾病可分為急性和慢性，急性腦缺血類疾病主要是腦卒中(又稱中風)，腦卒中造成的后果因不同缺血程度、部位而不同，重則直接致死、偏癱或昏迷不醒，輕則失去部分軀體感覺和運動功能。慢性腦缺血又稱為慢性大腦低灌注，是多種疾病的前奏，例如阿爾茨海默病，這類疾病一旦發病，將嚴重影響患者及其家庭的正常生活。

白楊素(Chrysin)的化學名是5,7-二羥基黃酮，是從紫葳科植物木蝴蝶中提取的一種具有廣泛藥理活性的黃酮類化合物，大量存在于蜂膠中，是蜂膠中的重要有效成分[1]。白楊素具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[2]。大量研究資料證明，炎性反應、氧化應激損傷和自由基損傷在腦缺血病理的發生發展過程中扮演著關鍵角色[3-5]。因而，應用白楊素治療腦缺血類疾病具有值得期待的價值。通過這項實驗，可了解白楊素對于急慢性腦缺血損傷是否具有防治作用，初步探討其作用機理和信號通路。

1材料與方法

1.1動物SPF級SD大鼠93只，雄性，體重260~290 g，購自第四軍醫大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK(軍)字第2007-007號，飼養于蘭州軍區蘭州總醫院實驗動物科。取大鼠隨機分為6組，其中急性大腦中動脈阻塞實驗3組即假手術組(Sham-MCAO組)、大腦中動脈阻塞模型組(MCAO組)和白楊素給藥組(MCAO+Chrysin組)；慢性大腦低灌注實驗3組即假手術組(Sham-CCH組)、慢性大腦低灌注模型組(CCH)和白楊素給藥組(CCH+Chrysin組)，具體分組按表1操作。

表1　實驗分組

1.2藥物與試劑白楊素(純度>98%，陜西慈緣生物技術有限公司)；TTC(Amresco公司，批號：20130108015)；T-AOC測試盒(批號：20130926)、CAT測試盒(批號：20130928)、MDA測試盒(批號：20130924)、SOD測試盒(批號：20130924)、H2O2測試盒(批號：20130929)、GSH-Px測試盒(批號：20130921)、GSH測試盒(批號：20130930)均購自南京建成生物工程研究所，所用化學試劑均為分析純。

1.3儀器酶標儀(美國MD公司，Spectramax i3)；制冰機(常熱市雪科儀器，IMS-20)；紫外可見分光光度計(美國HP公司，HP8453)；低溫高速離心機(德國BC公司，TDL80)；超低溫冰箱(海爾有限公司，L486)；去離子水制備儀(Millipore公司，Milli-Q)；電子pH計(Mettler Toledo公司，Delta 320)；渦旋儀(海門市其林貝爾儀器，Vortex5)；電熱恒溫水槽(上海精宏，DK-8A)；垂直凝膠電泳儀及電轉儀(美國Bio-RAD公司，BR)。

1.4MCAO模型的建立采用線栓法建立大鼠MCAO模型：①假手術組大鼠：麻醉后固定于鼠板，切開頸部皮膚，在左側頸總動脈、頸外動脈下穿線但不結扎；②模型組大鼠：麻醉后固定于鼠板，在頸部正中切開皮膚，暴露左側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，動脈夾夾住左側頸總動脈，結扎頸外動脈。在左側頸總動脈上靠近左側頸外動脈與頸內動脈的分叉處行一切口，插入預先制好的、前端帶有栓子的尼龍線，將線栓經左側頸總動脈插入左側頸內動脈，繼續進入顱內約1.5 cm，直至栓塞住大腦中動脈。阻塞90 min后，抽出線栓，恢復再灌注，并縫合切口[6]；③白楊素給藥組大鼠：白楊素在造模前灌胃給予，劑量為300 mg/kg，給藥時間為4 d。在最后一次給藥1 h后造模，方法與模型組相同。再灌注24 h后行神經功能學評分。

大鼠完成神經功能學評分后立即斷頭致死。其中10只大鼠取大腦行冰生理鹽水洗3次，清除殘血，之后用濾紙吸干，-80℃冰箱保存，后續用于生化指標和分子生物學指標檢測。其余6只大鼠取大腦行腦槽切片用于TTC染色評價梗死體積。

1.5CCH模型的建立采用改良的雙側頸總動脈結扎方法建立大鼠慢性大腦低灌注模型。具體步驟是35 mg/kg水合氯醛腹腔注射麻醉，碘伏消毒，頸部正中切開皮膚，在右側頸動脈三角處分離頸總動脈，用5-M縫線結扎右側頸總動脈，術區再次消毒后，縫合皮膚；1周后同樣方法結扎左側頸總動脈[7]。假手術組僅分離雙側頸總動脈，不結扎頸總動脈。術后存活且出現眼瞼下垂、靜臥等體征時表示造模成功。雙側頸總動脈結扎完成3 d后將存活動物隨機分為兩組并開始灌胃給藥，白楊素組給予30 mg/kg的白楊素，共給藥21 d，每天1次，假手術組和模型組給予與白楊素組相同體積的生理鹽水。然后斷頭致死實驗動物，取大腦，其中5只取出大腦后置于10%甲醛溶液里浸泡固定用于HE染色，另外10只制備組織勻漿用于測定生化指標和Western Blot分析。

1.6腦缺血再灌注大鼠神經功能學評分再灌注24 h后，觀察大鼠的狀態，提起鼠尾，觀察大鼠左側肢體的運動功能。神經功能評分采用Zea Longa 5級評分法[8]，評分標準：無顯著損傷表現為0分；不能舒展左側前肢為1分；圍繞左側轉圈為2分；向左側傾倒或倒向左側后不能恢復正常體態為3分；喪失意識，不能自主運動為4分。

1.7腦缺血再灌注TTC染色分析梗死體積完整取出大鼠的大腦置于腦槽上，將腦槽大腦置于冰上，用雙刃刀片插入腦槽中沿冠狀面切取2 mm寬度的切片。每顆大腦在不同位置切取5片切片，各個大腦切取切片的位置相同。將切片置于2%氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride， TTC)溶液中孵育約30 min，每隔5 min翻動一次。孵育完畢后置于4%福爾馬林中保存過夜，取出，用數碼相機拍攝照片，采用圖像處理軟件ImagePro plus 6.0[9]，分別計算出各樣本每個腦片損傷區的面積記為A，用以下公式進行梗死體積的計算：V=[2×(A1+A2+A3+A4+A5+A6)]mm3。

1.8HE染色觀察腦組織的病理改變將固定完成的大腦經過包埋、切片、洗滌、染色、脫水，透明和中性樹膠封片等步驟制成可視的病理切片，并在倒置顯微鏡下拍照成像。

1.9測定相關生化指標取腦組織標本，稱重后按質量體積比1:9加入冰生理鹽水，使用組織勻漿器在冰水浴中勻漿。按不同指標測定的要求采用相應的轉速離心，并取上清分裝，保存于-80℃冰箱中。各指標測定的具體操作按照南京建成生物工程研究所提供的說明進行。

1.10Western Blot檢測大鼠腦組織相關蛋白的表達取大腦組織樣本，按照1 mg組織比10 μl緩沖液的比例加入蛋白裂解緩沖液，提取待測腦組織總蛋白，經10%變性聚丙烯酰氨凝膠垂直電泳，采用濕轉法將蛋白質轉移至硝酸纖維素膜上，封閉后加入Nrf2、HO-1及β-actin一抗，置于4℃保存過夜后加二抗孵育2 h，ChemiDocXPS發光系統顯影。以Image J圖像分析軟件對圖像進行分析，以目的條帶與β-actin光密度的比值作為蛋白表達相對含量。

2結果

2.1腦缺血再灌注大鼠神經功能學評分的結果腦缺血再灌注造成模型組相對于正常組神經功能學評分由0顯著增加至2.65±0.38(P<0.01)，提示腦缺血再灌注對大鼠大腦造成了嚴重損傷；而白楊素組的神經功能學評分則在模型組的基礎上顯著下降至1.25±0.21(P<0.01)，提示白楊素具有減輕腦缺血再灌注損傷的效果。

2.2腦缺血再灌注大鼠TTC染色的結果如圖1所示，假手術組大腦切片為紅色，沒有梗死區域，模型組大腦切片上出現大塊白色梗死區域，經過計算，模型組梗死率為(41.6±6.2)%，顯示MCAO術后缺血區域大量細胞壞死；白楊素組梗死率顯著縮小至(19.5±2.8)%(P<0.01)，顯示白楊素發揮了良好的抗損傷作用，保護了急性腦缺血區域的細胞。

圖1　TTC染色顯示大腦梗死的情況(HE×100)Sham-MCAO指大腦中動脈阻塞模型假手術組；MCAO指大腦中動脈阻塞模型組；MCAO+Chrysin指大腦中動脈阻塞模型白楊素給藥組

2.3CCH大鼠大腦的HE染色結果如圖2所示，HE染色結果顯示假手術組大腦海馬區神經細胞排列規則有序，神經細胞的胞核呈正常的狀態；慢性大腦低灌注組大腦海馬區細胞排列散亂無序，出現大量胞核固縮的神經細胞；而給予白楊素后，情況明顯改善。

2.4相關生化指標測定的結果

2.4.1總抗氧化能力(T-AOC)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化氫(H2O2)的測定結果:相對于大腦中動脈阻塞模型組，白楊素組T-AOC、CAT均顯著升高(P<0.05)，H2O2降低;而相對于慢性大腦低灌注模型組，白楊素組T-AOC、H2O2、CAT基項指標變化趨勢與前者一致，且差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

圖2　慢性腦缺血大腦HE染色圖Sham-CCH指慢性大腦低灌注模型假手術組；CCH指慢性大腦低灌注模型組；CCH+Chrysin指慢性大腦低灌注模型白楊素組

表2　各組大鼠大腦中T-AOC、CAT活力、H2O2含量的測定結果

2.4.2谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原性谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的測定結果：相對于大腦中動脈阻塞模型組，白楊素組GSH-Px、SOD活力顯著提高，MDA含量下降(P<0.05或P<0.01)；而相對于慢性大腦低灌注模型組，白楊素組GSH-Px活力及GSH含量均升高(P<0.05)，SOD活力及MDA含量顯著下降(P<0.01)。見表3。

表3　各組大鼠大腦中GSH-PX活力、SOD活力、GSH含量和MDA含量的測定結果

2.4.3蛋白免疫印跡(Western Blot)的測定結果:假手術組Nrf2和HO-1的表達水平非常低；急性大腦中動脈缺血和慢性大腦低灌注模型組Nrf2和HO-1的表達水平有所提高；給予白楊素后，Nrf2和HO-1的表達水平顯著提高(P<0.05或P<0.01)。見圖3。

圖3　HO-1和Nrf2的表達情況Sham-MCAO指大腦中動脈阻塞模型假手術組，MCAO指大腦中動脈阻塞模型組，MCAO+Chrysin指大腦中動脈阻塞模型白楊素給藥組，Sham-CCH指慢性大腦低灌注模型假手術組，CCH指慢性大腦低灌注模型組，CCH+Chrysin指慢性大腦低灌注模型白楊素組；Nrf2指核因子E2相關因子，HO-1指血紅素加氧酶；與假手術組比較，aP<0.01；與MCAO組比較，bP<0.05；與CCH組比較，cP<0.05，dP<0.01

3討論

急慢性腦缺血導致缺血部位發生氧化應激，大量自由基被釋放并且破壞細胞結構。外源性給予能夠清除自由基的藥物可以防治此種損傷[8]。白楊素是一種具有抗氧化和清除自由基活性的藥物[9]。本項研究證實，白楊素是通過Nrf2-ARE信號通路來發揮抗腦缺血損傷作用的。

這些數據顯示白楊素有助于維持機體的抗氧化體系，有利于減輕腦缺血再灌注的損傷。白楊素能夠通過激活GSH-Px來清除H2O2等過氧化物從而減輕腦缺血再灌注損傷。還原性谷胱甘肽的測定結果顯示，在急慢性腦缺血損傷發生的部位，GSH含量下降，白楊素能夠提高GSH含量。GSH-Px SOD的測定結果顯示，在急性腦缺血再灌注損傷發生的部位，SOD活力下降，白楊素能夠提升SOD活力；而在慢性大腦低灌注損傷發生的部位，SOD活力由于機體的適應性調節而上升，白楊素減輕了損傷因而白楊素組的SOD活力低于模型組。MDA的測定結果顯示，相對于正常組而言，受到腦缺血再灌注損傷的部位，脂質過氧化大量發生，提示局部自由基損害的加重。相對于正常組，模型組和白楊素組的MDA水平顯著上升。白楊素表現出了幫助機體清除自由基從而減輕腦缺血再灌注損傷的效果。

Nrf2-ARE信號通路的主要作用是調控抗氧化酶系的表達，減輕氧化應激對細胞的損傷，是細胞抗氧化系統的“指揮”。氧化應激引起Nrf2與Keapl蛋白解偶連，然后進入細胞核與Maf蛋白結合形成異二聚體。這種異二聚體能夠識別抗氧化反應元件(ARE)，進而促進血紅素氧合酶-l(HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO1)等抗氧化酶系的表達[10-12]。其中HO-1是機體最重要的內源性保護酶系之一，也是細胞對抗氧化應激反應的重要組成部分[13-14]。

急慢性腦缺血在造成機體損傷的機制上存在一些差異，但也存在著重要的共性。急性腦缺血能夠引起大范圍的神經細胞壞死，而慢性腦缺血主要激活大腦細胞的凋亡信號通路，二者的共性就是導致神經元的大量減少，最終造成中樞神經系統的功能缺陷。急性腦缺血的發生通常是迅速、劇烈的，而且自由基累積、氧化型損傷等也呈現出爆發式狀態，而慢性腦缺血引發的損傷是相對溫和而持久延續的，因此導致機體長期處于氧化應激狀態，使機體不得不在各個方面做出調整以適應這種狀態，二者的共性是缺血引發的自由基累積和氧化型損傷破壞了機體內環境的平衡。

本實驗顯示，給予白楊素后，急慢性腦缺血造成的損傷得到改善，急性腦缺血大鼠的大腦梗死區域縮小，慢性腦缺血大鼠凋亡細胞減少；大鼠體內抗氧化酶系及自由基清除酶系被激活，同時，Nrf2-ARE信號通路相關蛋白的表達上調。這些結果顯示，白楊素通過Nrf2-ARE信號通路激活HO-1、SOD等抗氧化酶系，清除了缺血后產生的H2O2等過氧化物和自由基，減輕這些物質對大鼠腦組織造成的損傷。

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(收稿時間：2015-09-10修回時間：2015-10-20)

·論著·

Effect of Chrysin on Oxidative Stress and Nrf2/HO-1 Pathway in Rats after Acute or Chronic Cerebral Ischemia Injury

MA Hui-ping, WU Jin-hua, MENG Ping, WANG Ning, QI Xin-zhu, HE Lei, JIA Zheng-ping (Key Laboratory of Prevention and Cure for the Plateau Environmental Damage of PLA, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Military Area Command, Lanzhou 730050, China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the preventive and therapeutic mechanisms of Chrysin on MCAO (middle cerebral artery occlusion) and CCH (chronic cerebral hypoperfusion) injuries in rats. MethodsThe SD rat models of acute MCAO were established using suture-occluded method, and SD rat models of CCH were established using reforming ligation in bilateral common carotid artery. The injury degree was evaluated using nervous function score, TTC-staining and HE-staining, and its mechanisms were investigated using biochemistry indicators and western blotting. ResultsCompared with those in MCAO sham operation group (Sham-MCAO group), in the MCAO group, the values of nervous function score and occlusion area were significantly higher (P<0.01), while the total antioxidant capacity (T-AOC), activities of catalase (CAT), glutathion peroxidase (GSH-Px) and superoxide dismutase (SOD) were significantly decreased (P<0.05 or P<0.01), and the Nrf2 and HO-1 expressions were upregulated. The injury degree was improved after Chrysin therapy, the Nrf2 and HO-1 expressions were significantly upregulated, and the results of CCH sham operation (Sham-CCH group), CCH and CCH and Chrysin medication groups were similar to that of MCAO group. ConclusionChrysin may reduce the injuries of MCAO and CCH by upregulating Nrf2 and activating Nrf2-ARE pathway.

[Key words]Brain ischemia； Chrysin; Acute middle cerebral artery occlusion; Chronic cerebral hypoperfusion; Nrf2-ARE pathway

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.004

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R743.31A

[文章編號]2095-140X(2015)12-0015-06

[通訊作者]賈正平，E-mail：1026573411@qq.com

[基金項目][作者單位]730050蘭州，蘭州軍區蘭州總醫院藥劑科全軍高原環境損傷防治重點實驗室