胃腸間質瘤c-Kit和PDGFRA基因突變分析

孫　浩，李　衛，孫可心

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胃腸間質瘤c-Kit和PDGFRA基因突變分析

孫浩，李衛，孫可心

[摘要]目的分析胃腸間質瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)跨膜酪氨酸激酶受體c-Kit和血小板源性生長因子受體(platelet-derived growth factor, PDGFRA)基因的突變特征。方法對57例GIST石蠟標本進行DNA提取、PCR擴增和直接測序，檢測c-Kit外顯子9、11、13、17和PDGFRA外顯子12、18突變狀態。結果57例GIST標本中共檢出44例(77.2%)c-Kit/PDGFRA基因雜合性突變，未檢測到純合性突變。其中，c-Kit exon9突變9例(15.8%)，c-Kit exon11突變32例(56.1%)，c-Kit exon13突變2例(3.5%)，PDGFRA 18突變1例(1.8%)，c-Kit/PDGFRA均未檢測到突變的13例(22.8%)。結論中國人群c-Kit/PDGFRA突變比例高，突變類型多樣，其中c-Kit外顯子11比例高，進行c-Kit/PDGFRA基因分型有助于靶向藥物伊馬替尼的選擇和劑量估計。

[關鍵詞]胃腸間質瘤；c-kit；PDGFRA；基因突變

胃腸間質瘤(gastrointestinal stromal tumor, GIST)是胃腸道最常見的間葉來源腫瘤，依照目前的GIST診斷標準，新近流行病學研究顯示發病率0.66~2.20/10萬[1-3]。GIST對傳統化學治療極不敏感，化療藥物有效率不足5%，進展期中位生存率僅約18個月[4]。即使完整切除腫瘤，GIST的5年生存率也僅有35%～65%，2年內復發轉移率40%～50%，首診時多達15%~50%的患者存在轉移[5]。

研究發現干細胞因子表面的跨膜酪氨酸激酶受體c-Kit和血小板源性生長因子受體(platelet-derived growth factor, PDGFRA)基因的功能活化突變是GIST發生發展的關鍵[6]，針對以上分子靶點的靶向藥物伊馬替尼和舒尼替尼先后在2001年和2006年被FDA批準用于GIST的治療，改變了這一疾病的治療策略。伊馬替尼是一種小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)，已發現的主要分子靶點為Kit，PDGFR A/B和bcl-abl；舒尼替尼的分子靶點較前者更為豐富，可以對Kit、PDGFRs、VEGFRs、FLT3和RET產生抑制作用。它們可作為假底物與ATP競爭性結合Kit/PDGFRs受體的酪氨酸激酶位點，阻止其自身磷酸化，特異性抑制酪氨酸激酶受體，從而抑制腫瘤細胞的增殖。國際多中心Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗結果顯示伊馬替尼治療復發轉移/無法手術GIST，其臨床受益率80%左右(PR+SD)，中位生存時間由12個月提高至58個月，因此伊馬替尼治療GIST成為分子靶向治療實體瘤的經典[7-8]。

針對原發GIST或復發轉移的GIST，明確其c-Kit和PDGFRA基因突變狀態，對GIST進行精確的分子分型，篩選靶向藥物適宜患者，根據基因突變類型推薦合理治療劑量，是GIST個體化診療的重要環節。本研究回顧性總結了我院原發或復發轉移的GIST臨床資料及病理特征、c-Kit和PDGFRA基因突變類型，為實現GIST個體化治療提供依據。

1資料與方法

1.1一般資料收集我院2008年1月—2014年6月確診為GIST并接受基因檢測的患者57例。其中，男22例，女35例；年齡29~76歲，平均年齡54.0歲。57例GIST患者中原發腫瘤占80.7%(46/57)，胃原發腫瘤23例(40.3%)，小腸原發腫瘤20例(35.1%)，結直腸原發腫瘤3例(5.3%)。腫瘤直徑<5 cm13例，介于5~10 cm35例，大于10 cm9例。病理特征包括病理組織學和免疫組織化學(受體蛋白CD117、CD34、bcl-2、desmin、Ki-67，PDGFRA等表達情況)結果，并參照文獻[9-10]評估GIST病理組織學亞型：梭形細胞型、上皮樣細胞型和混合型細胞型。其中25例(43.9%)為梭形細胞型，4(7.0%)例為上皮細胞型，28例(49.1%)為混合細胞型。有54例CD117+(94.7%)，3例CD117-者均為CD34+。見表1。

表1　57例GIST患者的臨床和病理基本特征

1.2Kit和PDGFRA基因序列分析方法按照QIAGEN(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit)試劑盒操作說明提取石蠟組織腫瘤細胞基因組DNA。分光光度計檢測DNA濃度和純度，OD260/280值1.8~2.0方可進行下一步實驗。Kit基因第9、11、13、17外顯子及PDGFRA基因第12、18外顯子PCR引物序列參照文獻[11-12]，見表2。PCR反應體系為50 UL，反應條件為95℃變性5 min；94℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 25 s，循環35次，最后延伸5 min。PCR產物送到上海生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。其測序引物序列與PCR反應相同，測序結果采用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)軟件與NCBI公開發表的基因序列(c-Kit:NC_000004.11,PDGFRA:NC_000004.10)進行比對，分析其突變位點。

表2　Kit/PDGFRA基因PCR擴增引物序列

2結果

c-Kit和PDGFRA基因序列分析在57例GIST標本中共檢出44例(77.2%)c-Kit/PDGFRA基因雜合性突變，未檢測到純合性突變。其中，c-Kit exon9突變9例(15.8%)，c-Kit exon11突變32例(56.1%)，c-Kit exon13突變2例(3.5%)，c-Kit exon17未檢測到突變，PDGFRA exon12未檢測到突變，PDGFRA exon18突變1例(1.8%)，c-Kit/PDGFRA均未檢測到突變的13例(22.8%)，見表3。

表3　腫瘤定位和c-Kit和PDGFRA基因突變類型

c-Kit外顯子9的突變發生在胃有4例，小腸5例，均為編碼502~503密碼子丙氨酸和酪氨酸的6個核苷酸(GCCTAT)串聯重復插入突變，見圖1、2；c-Kit外顯子11的突變發生在胃有19例，小腸11例，后腹膜1例，突變類型多樣，其中點突變14例，缺失突變13例，如圖3、4所示，插入突變4例，其中發生在第557~560個密碼子12個核苷酸的點突變是其突變“熱點”，共8例；c-Kit外顯子13的突變有2例，均發生在小腸，突變類型為點突變；c-Kit外顯子17的突變有1例，發生在胃，突變類型為點突變；有1例發生PDGFRA外顯子18的突變，部位在小腸，為常見的D842V點突變。

圖1　野生型c-Kit外顯子9

圖2　c-Kit外顯子9的突變(GCCTAT)

圖3　野生型c-Kit外顯子11

圖4　c-Kit外顯子11的缺失突變

3討論

GIST是消化道最常見的間葉源性腫瘤，絕大部分表達Kit基因和PDGFRA基因編碼。c-Kit和PDGFRA基因位于人染色體4q12-13，屬于原癌基因，它們編碼的受體蛋白均屬于Ⅲ型酪氨酸激酶受體家族，具有相似的蛋白結構，分為4個區：膜外配體結合區、跨膜區、胞內近膜區和酪氨酸激酶區，后者又被一段插入序列分隔為ATP結合功能區(TK1)和磷酸轉移酶功能區(TK2)，ATP結合功能區是伊馬替尼與ATP競爭性結合的區域[11]。

正常情況下，Kit受體沒有活性，其活化需要干細胞因子(stem cell factor，SCF)的參與。在GIST細胞中，由于Kit/PDGFRA基因發生功能獲得性突變，相應的受體蛋白可在缺乏配體結合的情況下，發生自發性持續活化并激活下游的PI3K/Akt、RAS/MAPK和JAK/STAT3信號通路，導致腫瘤形成[12]。伊馬替尼是一種特殊的酪氨酸激酶抑制劑，經FDA批準可應用于c-Kit陽性、不能手術切除和/或轉移性的惡性GISTs的治療。其作用機理在于藥物結合于Kit蛋白胞漿內酪氨酸激酶功能區的ATP結合位點，阻斷磷酸基團由ATP向底物酪氨酸殘基的轉移，從而抑制細胞增殖并恢復細胞凋亡程序。

大部分GISTs均存在Kit基因突變，從而導致c-Kit蛋白的活化,不需要配體SCF參與就能刺激腫瘤細胞的持續增殖和抗凋亡信號的失控[13-14]。GISTs中Kit基因突變率約為90%，且突變形式多樣。其中位于11號外顯子Lys550-Val560區段的變異最為常見(占70~80%)，位于9號外顯子Ala502-Tyr503區段的6堿基重復突變約占5%~10%。本研究檢測出44例(77.2%)c-Kit/PDGFRA基因雜合性突變，約低于目前的研究報道，可能由于某些標本含腫瘤細胞數量少及一代測序方法靈敏度相對較低等因素導致少量標本出現假陽性等情況；c-Kit exon9突變9例(15.8%)，約低于江慧等[15]的研究結果，可能是由于c-Kit exon9突變發生與部位不同所致，如在小腸的突變率高于胃，而我們選擇的標本較多的來源于胃，這將影響c-Kit Exon9的突變比例。c-Kit exon11突變32例(56.1%)，與目前報道的結果接近。c-Kit exon13突變2例(3.5%)，PDGFRA exon18突變1例(1.8%)，接近目前的研究報道[15]。

檢測Kit基因突變對于指導GIST患者的合理用藥，具有重要的參考價值。臨床研究表明[13,16-17]，GIST中Kit基因的突變情況與格列衛分子靶向治療的療效相關：存在11號外顯子突變患者的療效最好，存在9號外顯子突變的患者療效次之，而Kit基因為野生型時，格列衛的療效最差。另外，對于9號外顯子突變的患者，提高用藥劑量可顯著提高療效。研究結果表明，對于Kit基因無突變的GIST患者，還需要檢測有無PDGFRA基因是否存在激活性突變(主要位于外顯子12、18)，PDGFRA外顯子發生突變的GIST病例對格列衛治療敏感。臨床研究顯示，伊馬替尼對GIST、腦瘤和黑色素瘤同樣有效[18]；PDGFRA外顯子18及外顯子12發生突變的多數GIST患者對伊馬替尼敏感。但PDGFRA外顯子18的D842V突變會導致GIST患者對伊馬替尼原發耐藥。因此，檢測腫瘤患者PDGFRA基因突變情況可用于預測伊馬替尼治療是否有效。對于外顯子突變類型差異與伊馬替尼療效的關系我們也在進一步觀察當中。

本研究結果提示c-Kit/PDGFRA基因突變比例高，突變類型多樣，而不同的突變類型與GIST靶向治療的選擇、伊馬替尼劑量的評估、療效及預后相關[13]。因此，檢測GIST的c-Kit/PDGFRA基因突變類型，根據遺傳特征對GIST患者進行個體化給藥具有十分重要的意義。

[參考文獻]

[1]王振華,梁小波.胃腸道間質瘤流行病學研究進展[J].國際流行病學傳染病學雜志,2013,40(3):211-214.

[2]劉念,耿小平.胃腸間質瘤的臨床診療進展[J].中華消化外科雜志,2006,5(4):291-294.

[3]宋晶宇,張學彥.胃腸間質瘤內鏡治療進展[J].臨床薈萃,2015,30(5):594-596.

[4]Iqbal N. Imatinib: a breakthrough of targeted therapy in cancer[J].Chemother Res Pract, 2014，19(6)：357027-357036.

[5]潘志中,伍小軍,姜武.胃腸間質瘤分子分型的實踐價值[J].中華胃腸外科雜志,2014,17(4):317-320.

[6]Sendur M A, Ozdemir N Y, Akinci M B,etal. Is exon mutation analysis needed for adjuvant treatment of gastrointestinal stromal tumor[J].World J Gastroenterol, 2013,19(1):144-146.

[7]Verweij J, Casali P G, Zalcberb J,etal. Progression free survival in gastrointestinal stromal tumours with high-dose imatinib:randomized trial[J].Lancet, 2004，15(3)：364-368.

[8]李楠靜,畢鋒,邱萌.胃腸道間質瘤的分子靶向治療進展[J].四川醫學，2010,31(1):117-119.

[9]Pauls K， Merkelbach, Bruse S，etal. PDGFRA and c-kit mutated gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are characterized by distinctive histological and immunohistochemical features[J].Histopathology, 2005,46(2):166-175.

[10]王春萌,師英強,董銳增.伊馬替尼耐藥胃腸間質瘤的免疫組織化學和基因特征[J].腫瘤,2008,28(12):1064-1068.

[11]Daniels M, Lurkin I, Pauli R,etal. Spectrum of KIT/PDGFRA/BRAF mutations and Phosphatidylinositol-3-Kinase pathway gene alterations in gastrointestinal stromal tumors (GIST)[J].Cancer Lett, 2011,312(1):43-54.

[12]徐佳,曹暉.胃腸間質瘤靶向治療耐藥的分子機制及治療策略[J].中華胃腸外科雜志,2013,16(3):288-291.

[13]Corless C L. Gastrointestinal stromal tumors: what do we know now [J].Mod Pathol, 2014,27(1):S1-16.

[14]Ma Y Y, Yu S, He X J,etal. Involvement of c-KIT mutation in the development of gastrointestinal stromal tumors through proliferation promotion and apoptosis inhibition[J].Onco Targets Ther, 2014，23(5):637-643.

[15]江慧,宋純,張桂榮,等.41例胃腸間質瘤c-Kit及PDGFRA基因突變分析[J].腫瘤學雜志,2013,19(11):832-837.

[16]朱 峰,董都選,張穎,等.食管癌/胃癌合并胃腸道間質瘤 2 例[J].西北國防醫學雜志,2013,34(6):536.

[17]Tap W D, Schwartz G K. That's the "GIST" of it: use of adjuvant imatinib after resection of a primary GI stromal tumor[J].J Clin Oncol,2014,32(15):1543-1546.

[18]Serrano C, George S. Recent advances in the treatment of gastro- intestinal stromal tumors[J].Ther Adv Med Oncol, 2014,6(3):115-127.

(收稿時間：2015-09-20修回時間：2015-10-21)

·論著·

Analysis of c-Kit and PDGFRA Gene Mutation in GIST

SUN Hao1, LI Wei1, SUN Ke-xin2(1. Department of Gastrointestinal Surgery, Chongqing Cancer Hospital Affiliated to Guangxi Medical University, Chongqing 400030, China; 2. the First Department of Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400030, China)

[Abstract]ObjectiveTo analyze mutation characteristics of transmembrane receptor tyrosine kinase c-kit and platelet-derived growth factor (PDGFRA) genes in gastrointestinal stromal tumor (GIST) patients. MethodsDNA extraction, PCR amplification and direct sequencing were performed in 57 paraffin-embedded GIST specimens in order to detect mutations of t-RTKS exon 9, 11, 13 and 17 and PDGFRA exon 12 and 18. ResultsA total of 44 cases (77.2%) of c-Kit/PDGFRA gene heterozygous mutation were detected among the 57 GIST specimens, but there was no homozygosity mutation. There were 9 cases (15.8%) of t-RTKS exon 9 mutations, 32 cases (56.1%) of t-RTKS exon 11 mutations, 2 cases (3.5%) of t-RTKS exon 13 mutations, 1 case (1.8%) of PDGFRA exon 18 mutation and 13 cases (22.8%) without t-RTKS/PDGFRA mutations. ConclusionThe t-RTKS/PDGFRA has high mutations rates in Chinese population with diverse mutation types, and mutations rate of t-RTKS exon 11 is high. The t-RTKS/PDGFRA genotyping may help to choose targeted drug Imatinib and evaluate the dose.

[Key words]Gastrointestinal stromal tumor; c-Kit; Platelet-derived growth factor; Gene mutation

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.12.008

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R735A

[文章編號]2095-140X(2015)12-0036-05

[通訊作者]李衛，E-mail:lwaq3356@sian.com

[基金項目][作者單位]400030 重慶市，廣西醫科大學附屬重慶市腫瘤醫院胃腸外科(孫浩、李衛)，重慶醫科大學2013級醫學一系丙三班(孫可心)