白細胞介素-18在糖尿病腎病大鼠模型中的表達水平及其對尿液腎損傷分子-1的影響

張孟姝　劉金磊　張春梅　劉學政

(遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧　錦州　121001)

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白細胞介素-18在糖尿病腎病大鼠模型中的表達水平及其對尿液腎損傷分子-1的影響

張孟姝劉金磊張春梅1劉學政2

(遼寧醫學院附屬第一醫院，遼寧錦州121001)

〔摘要〕目的探討白細胞介素(IL)-18在糖尿病腎病(DN)患者以及2型DN大鼠中的表達水平及其對尿液腎損傷分子(KIM)-1的影響機制。方法通過對高脂高糖高能量飼料喂養加小劑量注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導2型DN大鼠，檢測大鼠血清及組織中IL-18的表達水平以及尿液中KIM-1的水平。并通過對2型DN大鼠注射IL-18的中和抗體后，觀察血清及組織中IL-18的表達水平。結果與正常大鼠比較，STZ誘導的2型DN大鼠血清中IL-18的表達水平均顯著增加，且外周血單核細胞表達IL-18的mRNA水平顯著增加(均P<0.001)；此外，2型DN大鼠尿液中KIM-1的水平顯著增加(P<0.001)。對2型DN大鼠注射IL-18的中和抗體后，大鼠尿液中KIM-1的水平顯著降低(P<0.001)。結論IL-18可能對DN的發生發展有著一定的促進作用，該作用機制可能是通過影響尿液中KIM-1水平實現的。

〔關鍵詞〕白細胞介素-18；尿液腎損傷分子-1；糖尿病腎病

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最重要的微血管并發癥之一，已成為糖尿病患者致死的主要原因〔1〕。白細胞介素(IL)-18具有多種多樣的生物學活性〔2〕。多項研究提示了IL-18在糖尿病患者的發病及發展過程中發揮重要的作用〔3～6〕，然而，關于IL-18在DN中的作用研究尚不完全。本文旨在研究 IL-18 在DN患者中的表達水平，探討其與DN的關系。此外，通過采用DN大鼠的研究模型探討IL-18對腎臟損害的分子機制。

1資料與方法

1.1動物模型建立雄性SD大鼠(n=6)禁食15 h后，高脂高糖高能量飼料喂養大鼠，并使用鏈脲佐菌素(臨用前以0.1 mol/L，pH=4.2檸檬酸緩沖液溶解新鮮配置)按劑量60 mg/kg體重腹腔注射1次，于注射后72 h后取大鼠尾靜脈血測血糖，凡血糖≥16.7 mmol/L確定為糖尿病大鼠模型制作成功。

1.2主要試劑采用Trizol試劑盒(Life Technologies)提取組織及血清中的RNA；采用美國PROMEGA公司cDNA逆轉錄試劑盒對RNA進行逆轉錄；PCR試劑盒購于北京天恩澤公司。酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司。

1.3逆轉錄反應對于外周血標本：將新鮮的抗凝血用無菌的磷酸鹽緩沖液(PBS)以1∶2體積比混勻稀釋。緩慢加入淋巴細胞分離液中，2 000 r/min離心20 min，小心吸取中間層的外周血單核細胞。取1×106外周血單核細胞，加入到1 ml的Trizol后，按照說明書的要求抽提總RNA，所得RNA溶于25 μl焦碳酸乙二酯(DEPC)處理水。提取的總RNA經紫外分光光度計進行定量。進一步對所得RNA逆轉錄成cDNA，并將其于-20℃保存備用。IL-18引物序列為正義：5′-GCTTGAATCTAAATTATCAGTC-3′，反義：5′-GAAGATTCAAATTGCATCTTAT-3′〔7〕。對照采用 U6作為內參：序列為正義：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反應條件：95℃變性20 s，然后60℃ 20 s和70℃ 1 s進行50個循環。采用美國ABI公司的7900型號Real-Time PCR儀器進行分析，最終結果采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析〔8〕。

1.4ELISA法檢測血清IL-18采用上海拜力生物科技有限公司的人和大鼠的ELISA試劑盒檢測血清中IL-18的水平，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.5統計學方法采用SPSS19.0軟件進行t檢驗和Pearson相關分析。

2結果

2.1DN大鼠血清IL-18與尿液KIM-1的水平DN大鼠血清IL-18水平顯著高于正常大鼠〔(57.41±12.63)pg/ml vs(8.31±1.47)pg/ml，t=9.46，P<0.001〕；同時，DN大鼠外周血單核細胞IL-18的mRNA水平顯著高于正常大鼠(7.11±2.33 vs 1.11±0.27,P<0.001)。此外，2型DN大鼠尿液中KIM水平顯著高于正常大鼠〔(97.27±23.12)pg/ml vs(13.45±3.45)pg/ml，t=8.78，P<0.001〕。

2.2DN大鼠中和IL-18后抑制尿液KIM-1的水平注射了IL-18的抗體后，大鼠體內的IL-18顯著降低〔(51.23±11.45)pg/ml vs(15.23±5.41)pg/ml〕(P<0.05)，且大鼠尿液中KIM的水平顯著降低〔(42.26±16.23)ng/ml vs(93.45±21.33)ng/ml，t=8.78，P<0.001〕。

3討論

DN是糖尿病的主要慢性并發癥之一，也是導致終末期腎病的主要病因之一。目前，研究認為DN受多方面因素(血流動力學因素、代謝因素、遺傳因素、氧化應激等)影響。近年來，DN亦被認為是一種由糖脂代謝紊亂引發的炎性反應性疾病。越來越多的證據表明，固有免疫細胞的活化與慢性炎性反應是DN 的一個公認的發病因素〔9〕。細胞的激活和炎性分子的釋放，協同其他機制促使炎性反應的發生，是DN持續發展的關鍵性因素。研究認為，腎臟固有細胞在病理狀態下可以產生腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1、一氧化氮(NO)及IL-6等多種細胞因子，從而參與DN的發病與發展〔10〕。然而其他的炎癥因子與DN的關系研究尚不完全明確。

IL-18是另一類在人體內的多種細胞、多種組織器官中表達的細胞因子，其在正常狀態下濃度很低，然而在某些應急狀態下會產生高表達。有研究發現，將DN患者與非糖尿病患者進行比較，DN患者腎臟組織中的 IL-18 表達顯著升高〔11〕，提示了IL-18可能會在DN的致病過程中發揮重要的功能，且炎癥因子IL-18在DN的發病及發展中極其重要。Giunti等〔12〕發現2型糖尿病患者血清中IL-18水平增加，并且發現IL-18水平可以增加糖化血紅蛋白(HbA1C)及空腹血糖(FPG)的濃度，從而進一步佐證了本研究的結果。

KIM-1是腎臟近曲小管上皮細胞一種跨膜糖蛋白，其在正常肝、脾、腎中微量表達，而在受損后再生的近曲小管上皮細胞中表達顯著增強〔13〕，并能迅速、靈敏、特異地反映各種腎臟疾病的損傷及恢復過程。本研究結果提示炎癥因子IL-18可能與腎臟損傷有著密切關系。這與之前研究的人群結果一致〔14〕。而且IL-18可能參與DN損傷的發生，而抑制細胞因子IL-18對于糖尿病患者的腎損傷可能有著直接的治療作用。分析IL-18對DN的致病機制可能是通過促進TNF-α、IL-1β及干擾素(IFN)-γ等細胞因子的產生從而引起腎小球微循環發生改變、基質膨脹以及腎小球系膜細胞活化與增殖等病理過程〔15〕。

綜上所述，IL-18的高表達在DN的發生、發展中起著重要的作用，其可能通過促進KIM-1水平來影響腎臟功能。抑制IL-18可能是臨床上治療糖尿病腎損傷的有效手段，值得臨床進一步驗證。

4參考文獻

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〔2015-08-10修回〕

(編輯袁左鳴/滕欣航)

〔中圖分類號〕R517.1

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1308-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.013

通訊作者：劉學政(1962-)，男，教授，博士生導師，主要從事糖尿病視網膜病變治療方面的研究。

1錦州石化醫院2遼寧醫學院

第一作者：張孟姝(1982-)，女，碩士，主管護師，主要從事糖尿病并發癥方面的研究。