髓核細胞與干細胞共培養的研究進展

薛鵬舉敖 俊* 趙利濤郭明柯呂海文姬文慧黃歡歡秦耀宗張偉鋒周衛敏

（1 河南科技大學第二附屬醫院，河南 洛陽 471000；2 遵義醫學院脊柱外科，貴州 遵義 563003）

髓核細胞與干細胞共培養的研究進展

薛鵬舉1敖 俊2* 趙利濤1郭明柯1呂海文1姬文慧1黃歡歡1秦耀宗1張偉鋒1周衛敏1

（1 河南科技大學第二附屬醫院，河南 洛陽 471000；2 遵義醫學院脊柱外科，貴州 遵義 563003）

討論開展髓核細胞與干細胞共培養相關研究現狀進展。通過對種子細胞、共培養方式、生長因子等方面國內外研究進展進行討論。通過椎間盤組織細胞與干細胞共培養增加細胞數量或誘導干細胞分化為髓核細胞可能是一種增加椎間盤細胞較為適當的方法。通過細胞共培養技術可能分泌延緩退行性變在組織細胞中發生發展提供新的途徑，也是目前研究的熱點。基礎研究及臨床應用有著廣闊科研前景。

干細胞；共培養；椎間盤組織工程學；髓核細胞

椎間盤退行性變常是的下腰痛病因，患者生活質量受到嚴重影響，甚至有一定的致殘率。近年來椎間盤退行性變的發病率呈逐漸上升。從病理學上觀察，由于髓核細胞合成分泌Ⅱ型膠原蛋白的能力出現下降，使細胞外膠原蛋白種類成分改變，將導致椎間盤結構的變化和功能的減退[1]。若從改善髓核細胞功能入手，使髓核的再生或減慢老化。就現有治療而言，臥床休息與牽引治療只能夠暫時性的緩解患者的疼痛等臨床癥狀，無法延緩或逆轉椎間盤退變的發展。而各種手術雖去除了發生退變的椎間盤，但易產生術后腰椎不穩，椎弓根釘棒系統內固定使局部脊柱活動度下降，臨近椎間盤負荷過多，導致臨近椎體出現退變過早發生。椎體間植骨融合不僅治療費用昂貴，且存在植骨不愈合可能。安裝非融合內固定，以盡量恢復原有關節活動度，亦存在內固定物松動、脫落等風險。因此，治療椎間盤退行性變的關鍵應該在椎間盤的退變的病理組織結構基礎的改變，恢復椎間盤原有結構基礎與主要功能。現階段國內外主要的研究集中在采用組織工程學技術和方法直接修復退變的椎間盤髓核組織，從而使椎間盤組織結構和功能恢復。具體就是促進椎間盤細胞分泌正常的椎間盤細胞外基質，改善椎間盤細胞生存的微環境，并且通過抑制用于分解代謝過程的相關酶及炎性介質，促進其恢復正常功能與結構。由于髓核組織體積較小，易造成組織分離提取困難，即便培養出的髓核細胞，其數量及擴增亦較為困難，且其形態易出現老化[2-3]。通過椎間盤組織細胞與干細胞共培養增加細胞數量或誘導干細胞分化為髓核細胞可能是一種增加椎間盤細胞較為適當的方法。通過細胞共培養技術可能分泌延緩退行性變在組織細胞中發生發展提供新的途徑，也是目前研究的熱點。本文就人髓核細胞與干細胞共培養方面進行研究現狀的討論。

1 種子細胞

1.1 椎間盤細胞：正常人類的髓核組織，在兒童時期存在脊索細胞和髓核細胞兩種細胞，但隨著年齡的增長脊索細胞持續減少，大約超過10歲后絕大部分被髓核細胞所取代[4-7]。大部分關于脊索細胞的研究多見于動物實驗中，而對人類椎間盤髓核組織的研究而言，髓核細胞的研究明顯較脊索細胞更具有實際意義。許多需要行手術切除髓核組織的患者，以成年人多見。但人類髓核細胞體外增殖的能力弱，同時體外培養條件較為嚴格。而成人椎間盤組織內含有的髓核細胞數量少，且容易老化。人髓核細胞來源亦成為，現有學者以先天性脊柱側彎患者所行的矯形手術中獲得切除的椎間盤髓核組織為研究來源，但先天性脊柱側彎疾病發病率相對其他病種低，病源有限。亦有學者通過對椎間盤突出患者所行的椎間盤髓核摘除術中獲得髓核組織，但此類患者的椎間盤已發生退行性變，患者年齡往往偏大，所獲得的髓核細胞增殖能力及合成蛋白的功能不能肯定，將此作為種子細胞應用于組織工程學研究或臨床治療可能并不恰當。筆者臨床工作中發現許多人頸椎骨折患者需要行前路手術摘除髓核組織，而摘除后的髓核組織，最終被手術人員丟棄，通過對人頸椎骨折患者術中摘除的髓核組織研究發現其可以培養出髓核細胞，而此類患者具有年齡較小，患病人數高且穩定，取材簡便的特點。因此現階段開展髓核細胞相關研究，應結合當地特點，選擇適宜髓核細胞的來源。髓核細胞一直缺乏統一的鑒定標準。現階段對髓核細胞的研究多采用Ⅱ型膠原蛋白免疫組化方法結合細胞形態學特點進行鑒定。鑒于流式細胞技術在細胞實驗研究的廣泛，有學者探索使用熒光抗體結合細胞表面標志物來鑒定細胞。但目前研究發現，髓核細胞缺乏高度表達且特異性高細胞表面標志物，使得流式細胞技術鑒定髓核細胞仍處于實驗階段，而髓核細胞新的鑒定技術本身就是正在處于研究的課題。

1.2 干細胞：干細胞具有分化為臨近組織內其他細胞的能力，這可能是受損組織能進行自我修復的原因。這就為老化受損的椎間盤提供了一種新的修復可能，也為稀缺的髓核細胞提供了新的擴增方法。但最為原始干細胞的胚胎干細胞，盡管理論上分化潛能最強，但受倫理學及相關法律文件限制，只能在動物實驗范圍內進行，所取得的成果一般無法同樣在人細胞相關領域應用。選擇倫理學爭議較少的干細胞進行研究，用于椎間盤髓核細胞組織工程學相關研究是需要開展的研究領域。現階段間充質干細胞常見于文獻報道，但間充質干細胞種類繁多，需要大量實驗開展以選則合適的干細胞用于髓核細胞相關研究。現階段對骨髓、脂肪以及臍帶等易獲組織來源進行提取，不僅是間充質干細胞易于培養，其分化誘導能力已經逐漸被研究人員所證實。而最近人臍帶血間充質干細胞因其較其他細胞分類上更為原始，而因其科研工作者的重視。而現在此細胞的培養技術已較為成熟。從現有文獻來看，臍帶血源性間充質干細胞可以被分化為內、外及中胚層的部分細胞[8]。而人髓核細胞系從內胚層分化而來。諸如脂肪細胞、神經細胞及干細胞可以由此種干細胞誘導出來。而肝臟細胞屬于內胚層分化細胞，若能存在被誘導分化為肝細胞的間充質干細胞，將更有可能被誘導分化為椎間盤細胞。與華通膠類的組織相比，臍帶血作為血液可能更容易提取細胞。一般組織類物質需要酶消化法或組織塊法進行提取，此方法一般耗時較多。而血液源性細

胞的提取，則依靠密度差異進行離心獲得，可以省去大量操作時間。據現有文獻報道，大部分間充質干細胞用于髓核研究的多是利用骨髓或脂肪為來源。而更為原始，分化能力可能更強，具有向內胚層細胞分化能力的臍帶血間充質干細胞則未見文獻報道與誘導髓核細胞的相關研究。在品種繁多的各種間充質干細胞中，篩選出最為適宜作為髓核細胞共培養是目前有待探索的項目。如果以治療椎間盤退行性變為目的，則不僅需要此類干細胞具有增加髓核細胞數量作用，還應該具備維持細胞蛋白合成和表達的能力。現階段通過基因擴增技術，蛋白印記技術均可以更為準確檢測出蛋白合成的變化。而細胞共培養技術又能為細胞分化、增殖和改善蛋白合成及分泌提供途徑。已有研究發現骨髓造血干細胞分泌信號因子，可以作用于共培養體系中的髓核細胞，從而產生使髓核細胞增殖并提高蛋白表達的作用。由此可見，細胞共培養技術是可以用于椎間盤組織工程學研究的，它可以為細胞信號因子及細胞間接觸性傳代的物質提供適宜場所，延緩髓核細胞的老化。可見，如果能獲得大量關于間充質干細胞與髓核細胞共培養的結論性信息，應該可以為椎間盤退行性變的臨床治療提供更多特殊手段，比如是否可以通過細胞移植的方法延緩組織老化過程等，這些由都需要大量實驗來完成對它的了解。趙晨成[9]研究發現骨髓間充質干細胞具有著向椎間盤細胞分化的能力，而且其與髓核細胞的作用可能是相互促進的。一些間充質干細胞分泌的細胞調節因子可能作用于髓核細胞內，使得膠原蛋白表達得以增強。這就提示我們，即便是一些干細胞不能被誘導分化為椎間盤細胞，也存在著臨床應用治療退變的潛在價值。而不單局限于僅靠培養出的髓核或類髓核細胞的移植來修復老化的椎間盤。現有文獻可見被誘導為髓核細胞的干細胞[10-12]。但研究并為擴大至全部可以培養的間充質干細胞，于海微[13]對比多種間充質干細胞發現在誘導分化能力上可能人臍帶血間充質干細胞較強，故而筆者推薦有其他間充質干細胞培養經驗的科研團隊，嘗試使用臍帶血間充質干細胞進入髓核細胞領域的研究。只用通過更多種類的干細胞共培養才能明確適宜椎間盤修復的相關研究。另外，除分化至內胚層源性細胞外，臍帶血間充質干細胞還有很多生物學特性與髓核細胞相類似。比如其原代貼壁時長等較慢等。凡間充質干細胞均可采用同樣的流式細胞儀技術，對其細胞膜表面的特異分子進行鑒定。故而有骨髓間充質干細胞培養經驗的實驗室可以更為容易地進行此類細胞的培養及鑒定。而髓核細胞與干細胞共培養，應當擴大干細胞種類的范圍，以尋找適合椎間盤組織工程學種子細胞。

2 共培養的方式

細胞共培養是細胞生物學研究的重要方法，通過將兩種不同種類的細胞放置在同一個容器中進行培養，通過直接或間接接觸，從而促使細胞產生特定的作用。但兩種細胞以不同的比例共培養后，結果可能有所不同。若干細胞數量較少，可能難以分泌促進髓核細胞增殖或合成蛋白的細胞因子等物質。如果髓核細胞數量較少，則可能不能誘導干細胞定向地往類髓核細胞方向分化。所以共培養時不同細胞所需添加的不同比例，也是在細胞共培養時需要研究的問題。謝小波通過實驗研究發現，髓核細胞與骨髓間充質干細胞進行細胞共培養時，當髓核細胞和骨髓間充質干細胞比例為1∶3～2∶l時，髓核樣細胞增殖能力會隨髓核細胞相對數量增加而降低，而這一比例繼續增加時，髓核樣細胞增殖能力無明顯提高或降低。盡管大多文獻支持間充質干細胞略多于髓核細胞時，能促進髓核細胞的增殖。但對于初次進行細胞共培養的學者來說，常規可以選擇1∶1比例培養進行嘗試。

可采用不同細胞直接混合的接觸式共培養，也可采用細胞表面相互分隔的非接觸式共培養實現不同細胞相互誘導作用的研究。接觸式共培養是按不同比例混合細胞進行培養，不同種類細胞可以直接接觸，通過細胞分泌的細胞因子或直接接觸相互作用。通過接觸式共培養，不同種類的細胞可以獲得更大的接觸面積，誘導作用可能更為顯著。由于接觸式共培養，細胞間物質傳遞距離較短，誘導作用的發生也可能較早。而非接觸共培養則將細胞種植于通過具有微小空隙的共培養容器或材料中，使不同種類的細胞隔開。不同細胞旁分泌出的細胞信號因子釋放入共培養中共用的培養液，但不同種類的細胞彼此不直接接觸。細胞因子再通過穿梭于容器或材料中的微小的空隙，作用于共培養容器或材料中的不同種類的細胞。現階段研究表明，接觸式共培養更利于髓核細胞對間充質干細胞發揮誘導分化的作用[14]，由于接觸式共培養體系下，髓核細胞與間充質干細胞可以充分接觸，誘導機制可以通過旁分泌細胞信號因子和直接細胞膜接觸等多種方式進行。但非接觸共培養由于有微孔材料的分隔開，對實驗結果的后期處理較接觸式共培養容易。非接觸共培養用的Transwell培養板的培養孔內由聚碳酸酯膜分隔成兩層，孔徑大小一般可在微米水平范圍內選擇。因此可以將不同種類的細胞分別種植于Transwell培養板的不同隔層進行共培養。由于細胞沒有直接混合在一起，需要單獨分析間充質干細胞或者髓核細胞時，Transwell培養板可以通過酶消化獲得。亦有學者使用藻酸鈉微球來實現細胞共培養。藻酸鈉微球通過藻酸鹽溶液與氯化鈣混合形成，共培養結束后，可以通過檸檬酸鈉溶液溶解微球獲得微球內的細胞[15]。而若共培養方式采用直接接觸式，則需要預先對某一種細胞進行特異性的熒光標記，以便在共培養結束后通過流式細胞儀的篩選，恢復原先細胞所在的種類。由于細胞對不同材料親和力，選擇何種材料利于種子細胞生長亦成為組織工程學研究的方向之一，李長青通過對髓核細胞在不同支架上培養研究，證實由殼聚糖聯合藻酸鹽凝膠所制作的支架利于髓核細胞的培養[16]。

3 生長因子

最近研究發現，在細胞因子的誘導下，細胞的生長速度、分化方向等都可能發生改變。在脂肪間充質干細胞與髓核細胞細胞用Transwell培養板共培養時，轉化生長因子β1/胰島素樣生長因子1 具有促進脂肪間充質干細胞分化為髓核細胞的趨勢[17]。滿孝旭認為肝細胞生長因子對髓核細胞是否也有促進增殖作用，且能在聯合應用胰島素樣生長因子1下促進增殖作用增強[18]。在已知能促進細胞增殖以及具有增加細胞蛋白表達的各種細胞信號因子中，篩選出能有效作用于髓核細胞促進其增殖，或者增加其誘導干細胞向類髓核細胞分化上的作用是必要的。

4 小 結

髓核細胞與干細胞共培養是椎間盤組織工程學研究的重要途徑，科研范圍較為廣闊。隨著國內外研究的進展，髓核細胞與干細胞共培養技術將為椎間盤組織工程學提供更多的思路和方法，遠期也將推動椎間盤退行性變的新的治療技術的進步。

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R318.0；R68

A

1671-8194（2016）32-0022-03

胸腰椎爆裂骨折單側椎管減壓椎體內植骨、椎弓根螺釘固定術的生物力學研究，貴州省科技廳科學技術基金課題No：黔科合J字20102179號

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