煙草類黃酮合成相關(guān)基因

陳 帥，楊愛國（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

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煙草類黃酮合成相關(guān)基因

陳 帥，楊愛國*
（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101）

摘 要：類黃酮是煙草中普遍存在的多酚化合物，是煙草重要的致香前體物質(zhì)，其合成代謝是煙草香氣物質(zhì)形成的重要途徑。對近年來煙草類黃酮合成相關(guān)基因的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，并展望了其在煙草中調(diào)控重要基因表達(dá)和提高煙葉品質(zhì)中的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：煙草；類黃酮；結(jié)構(gòu)基因；調(diào)控基因；應(yīng)用

類黃酮（flavonoid）是一類廣泛存在于植物中的次生代謝物質(zhì)。類黃酮參與植物的生長發(fā)育、花和果實的著色反應(yīng)以及抗逆反應(yīng)。迄今為止，對植物體內(nèi)類黃酮合成代謝途徑的研究已較為深入，途徑中的一系列關(guān)鍵酶基因（結(jié)構(gòu)基因）和轉(zhuǎn)錄因子（即調(diào)控基因）已在多個物種中被相繼報道。類黃酮不僅對煙草的生長發(fā)育起重要作用，而且是煙葉品質(zhì)的關(guān)鍵影響因素。類黃酮中的綠原酸、蕓香苷等與煙葉的香氣、色澤及品質(zhì)密切相關(guān)，賦予煙氣清甜香和烤香［1］；此外，煙葉等級的高低很大程度上取決于煙草中蕓香苷和綠原酸的含量高低，一般情況，煙葉級別較高時，蕓香苷和綠原酸在煙葉中所占的比例也較高［2］。因此，煙草類黃酮物質(zhì)合成代謝調(diào)控對研究煙草生長發(fā)育和煙葉香氣品質(zhì)具有重要意義。

1 植物類黃酮合成關(guān)鍵酶基因和調(diào)控基因

1.1 植物類黃酮合成關(guān)鍵酶基因

類黃酮化合物主要通過苯丙烷代謝途徑和類黃酮代謝途徑來合成。類黃酮化合物的合成起始于L-苯丙氨酸，其在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用下形成反式肉桂酸，隨后在肉桂酸-4-羥化酶（C4H）和4-香豆酸 CoA的連接酶 （4CL）等關(guān)鍵酶的作用下形成4-香豆酸-CoA。4-香豆酸-CoA提供了苯丙烷代謝途徑與類黃酮代謝途徑之間的代謝聯(lián)系。4-香豆酸-CoA通過查爾酮合成酶（CHS）進(jìn)入類黃酮合成代謝途徑［3］。CHS是類黃酮代謝途徑的第一個關(guān)鍵酶，它催化一分子的4-香豆酸-CoA與三分子的丙二酰-CoA形成柚配基查爾酮。隨后，柚配基查爾酮在CHI、DFR、FLS、F3H、ANS、UGT等一系列酶的作用下進(jìn)入不同的分支合成代謝途徑，衍生轉(zhuǎn)化形成黃酮、黃酮醇、黃烷醇、類黃酮醇、花青苷等各類黃酮化合物［4］。

植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個類黃酮合成途徑中關(guān)鍵酶基因的突變體，如擬南芥中已經(jīng)分離到多個關(guān)鍵酶基因的突變體，包括tt3、tt4、tt5、tt6、tt7、tt10、tt15、tt18/tt11/tdsA、fls1、ban，對應(yīng)的結(jié)構(gòu)基因分別是DFR、CHS、CHI、F3H、F3’H、PPO、GT、LDOX、FLS和ANR［5］。研究發(fā)現(xiàn)，CHS、CHI、DFR、F3H、ANS和ANR與植物花色相關(guān)，調(diào)控上述基因的表達(dá)水平，能夠顯著地影響植物花青素和原花色素的含量變化［6-10］。FLS與DFR存在競爭共同底物的關(guān)系，利用二氫黃酮醇分別催化合成黃酮醇和花青素。擬南芥fls1突變體中花青素的含量增加，而幾乎檢測不到黃酮醇的含量［11］。對共同底物的競爭結(jié)果將決定花的顏色以及黃酮醇含量的變化［12］。

1.2 植物類黃酮合成調(diào)控基因

類黃酮化合物合成的調(diào)控主要包括轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，MYB類轉(zhuǎn)錄因子、bHLH類轉(zhuǎn)錄因子、WD40類轉(zhuǎn)錄因子和WRKY類轉(zhuǎn)錄因子等主要參與類黃酮合成代謝的調(diào)控［13-14］。MYB類轉(zhuǎn)錄因子、bHLH類轉(zhuǎn)錄因子和WD40類轉(zhuǎn)錄因子往往形成MYB-bHLH-WD40復(fù)合體（簡稱MBW復(fù)合體）起調(diào)控作用［15］。上述轉(zhuǎn)錄因子形成一個復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，控制著類黃酮合成代謝的時空特異表達(dá)及其表達(dá)水平，對于這些轉(zhuǎn)錄因子的研究能夠為控制類黃酮合成代謝提供重要的理論依據(jù)。

目前，擬南芥中參與類黃酮合成途徑的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)研究得比較清楚［13］。MYB類轉(zhuǎn)錄因子包括PFG1/PFG2/PFG3、PAP1/PAP2、TT2、AtMYB12、AtMYB113和AtMYB114等正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，以及參與負(fù)調(diào)控的 MYB4亞家族的 AtMYB3/4/7/32和R2-MYB、R3-MYB等轉(zhuǎn)錄抑制因子［16-18］。bHLH類轉(zhuǎn)錄因子包括GL3/ EGL3、tt8［19］，WD40類轉(zhuǎn)錄因子ttg1［20］以及WRKY類轉(zhuǎn)錄因子ttg2［21］等。這些轉(zhuǎn)錄因子可以通過互作共同調(diào)控類黃酮途徑，也可直接調(diào)控［13，22］。

2 煙草類黃酮合成關(guān)鍵酶基因和調(diào)控基因

2.1 煙草類黃酮合成關(guān)鍵酶基因

目前已從煙草中分離或克隆獲得多個參與類黃酮合成代謝途徑的關(guān)鍵酶基因，這些基因在煙草基因組中大多以多拷貝形式存在，且在不同組織和器官中呈現(xiàn)時空特異表達(dá)的特性［23-25］。賈宏等［26］對廣東、安徽和河南3個不同生態(tài)區(qū)的烤煙品種的類黃酮合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同生態(tài)區(qū)不同品種間關(guān)鍵酶基因PAL、CHS和CHI的表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)趨勢差異較大，C4L和4CL的表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)趨勢差異較小，說明PAL、CHS和CHI，尤其是CHI基因在3個生態(tài)區(qū)濃香型烤煙類黃酮物質(zhì)形成中起關(guān)鍵作用。基因功能研究發(fā)現(xiàn)，莽草酸/奎寧酸羥基肉桂酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）參與煙草綠原酸的合成，過量表達(dá)NtHCT基因能夠使轉(zhuǎn)基因煙草中綠原酸、蘆丁、山奈酚蕓香苷等類黃酮物質(zhì)含量得到很大程度的提高［27］。通過過表達(dá)或RNAi干擾技術(shù)調(diào)節(jié)煙草查爾酮酶基因（CHS）的表達(dá)量，也能夠影響轉(zhuǎn)基因煙草中綠原酸、蕓香苷等類黃酮化合物以及多酚物質(zhì)含量的變化［28］。Atanassov等［29］在野生煙草花藥中克隆到一個組織特異表達(dá)的查爾酮合成酶基因（NSCHSLK），分析發(fā)現(xiàn)其與花粉單核孢子的發(fā)育相關(guān)。研究表明CHS基因與雄性不育有關(guān)，CHS基因的異常表達(dá)使得花粉無法正常合成黃酮類物質(zhì)，導(dǎo)致植株無法供應(yīng)花粉正常發(fā)育所需的營養(yǎng)，從而導(dǎo)致花粉不育［30-32］。抑制煙草中CHI基因的表達(dá)，能夠降低煙草花色素含量，改變花瓣中類黃酮物質(zhì)含量［33］。過量表達(dá)DFR或F3’5’H基因，都能夠引起煙草花色加深［34-35］。Mahajan等［36］研究發(fā)現(xiàn)，抑制或沉默F(xiàn)LS基因表達(dá)的轉(zhuǎn)基因煙草的花期延后，并且煙草果實的籽粒數(shù)減少或產(chǎn)生無籽果實。轉(zhuǎn)基因煙草中黃酮醇、花青素含量降低，而黃烷醇類物質(zhì)如兒茶酚、焦兒茶酸等含量升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，含量升高的黃烷醇類物質(zhì)能夠增強(qiáng)谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸過氧化物酶（APx）、過氧化物酶（CAT）等抗氧化酶轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量，而降低谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量［37］，增強(qiáng)植株對活性氧的清除能力。過量表達(dá)NtUGT1基因降低轉(zhuǎn)基因煙草葉片中類黃酮化合物如二氫山奈酚、山奈酚-3-蕓香苷、二氫槲皮素、蘆丁等物質(zhì)含量［38］。

2.2 煙草類黃酮合成調(diào)控基因

煙草中含有種類繁多、含量豐富的類黃酮物質(zhì)，調(diào)控其合成代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)也非常復(fù)雜，涉及到眾多的調(diào)控因子。目前在煙草中分離到的參與類黃酮合成代謝的轉(zhuǎn)錄因子較少，主要是MYB-R2R3類轉(zhuǎn)錄因子和bHLH類轉(zhuǎn)錄因子。MYB-R2R3類轉(zhuǎn)錄因子 NtAn2 是最早在煙草花器官中克隆到的參與類黃酮代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子。在擬南芥和煙草中異位表達(dá)NtAn2能夠引起整株植株的花青素積累，而抑制其表達(dá)則導(dǎo)致植株花色變白［25］。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，低溫條件下NtAn2的上調(diào)表達(dá)是花青素積累所必需的，并激活花青素合成酶基因NtANS的表達(dá)［39］。Bai等［40］從煙草花器官中分離到兩個bHLH轉(zhuǎn)錄因子，NtAn1a和NtAn1b。研究發(fā)現(xiàn)，NtAn1a 和NtAn1b與NtAn2之間存在強(qiáng)烈的蛋白互作。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)NtAn1a、NtAn1b 與 NtAn2三者單獨存在均不能激活類黃酮合成途徑的兩個關(guān)鍵基因DFR 或 CHS 的啟動子，但將NtAn1a、NtAn1b分別與NtAn2組合后 （NtAn1a + NtAn2 或 NtAn1b + NtAn2） 均能激活兩個啟動子，說明 NtA n1 和NtAn2 蛋白共同參與煙草花中花青素途徑的調(diào)節(jié)。

3 前景與展望

類黃酮合成代謝途徑非常龐大，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有至少8條分支代謝途徑，目前對花青素合成分支途徑的研究較為深入，而其他分支途徑的研究還尚待深入。在煙草中，類黃酮代謝是煙草香氣物質(zhì)形成的重要途徑。對煙草類黃酮合成代謝途徑關(guān)鍵酶基因和調(diào)控基因的研究對于提高煙草品質(zhì)有著重要的意義。此外，通過轉(zhuǎn)基因手段或基因編輯技術(shù)，調(diào)控?zé)煵莼ê腿~片中花青素合成相關(guān)基因或轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量，形成各類顏色的觀賞煙草，能夠提高煙草的觀賞價值；調(diào)控?zé)煵萑~片中類黃酮化合物合成的關(guān)鍵基因或轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量，獲得能夠高產(chǎn)蕓香苷、綠原酸、兒茶酚、槲皮素等強(qiáng)藥理活性物質(zhì)的煙草植株或煙草懸浮細(xì)胞系，提高煙草在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的利用價值，對拓展煙草綜合利用市場以及對煙草行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展都具有非常重要的意義。

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Tobacco Flavonoid Biosynthesis and Related Genes

CHEN Shuai， YANG Aiguo*
（Tobacco Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract:Flavonoids are a common group of polyphenolic compounds and the most important precursors for aroma components in tobacco （Nicotiana tabacum）.In this paper， the current research progress on the related genes of tobacco involved in flavonoid biosynthesis pathways was summarized.It provided useful information for application of the molecular regulation of flavonoid biosynthetic genes for improvement of tobacco leaf quality.

Keywords:tobacco； flavonoid； structural gene； regulator gene； application

中圖分類號：S572.03

文章編號：1007-5119（2016）02-0095-04

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.02.017

作者簡介：陳 帥（1985-），在讀博士，主要從事煙草分子育種研究。E-mail：chenshuai019@126.com。*通信作者，E-mail：yangaiguo@caas.cn

收稿日期：2016-04-05