5-FU-PLGA復乳微球的制備及體外釋放

黃慧玲，李 益，王 玥，魏振平

（天津大學化工學院，天津 300072）

5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是治療消化道癌癥的首選藥物，臨床上主要用于治療胃、肝、腸等多種癌癥。但其本身存在治療劑量大，不良反應多如胃腸道反應、骨髓抑制等［1-2］安全性問題。另外5-FU的半衰期只有10～20 min，在體內滯留時間短，口服吸收不完全，生物利用度低［3-4］，故需要頻繁給藥。為了降低5-FU的毒性，延長半衰期，減少給藥次數，提高生物利用度，本研究包含5-FU的可生物降解緩釋微球的制備工藝。

復乳在藥劑學、食品等領域有廣闊的應用前景。W/O/W型復乳是具有兩膜三相結構的多相體系，包括內水相、油相和外水相，在相界面處有內油水界面膜和外油水界面膜，可以將一些性質不同的物質溶解在不同的相中，起到隔離、保護、緩釋、控釋、靶向釋放等效果［5-7］。本實驗中將 5-FU包入W/O/W型復乳中制備微球。

復乳本質上是熱力學不穩定體系，儲存和使用過程中極易發生絮凝、聚結和分層，同時還有很多因素會影響復乳的穩定性，使復乳的實際應用受到許多限制［8-11］。本研究采用復乳溶劑揮發法，以乳層保留率為指標，單因素考察了第一相體積比、第二相體積比對復乳穩定性的影響。在此基礎上，以包封率為指標，采用L9（34）正交設計表優化處方組成與制備工藝，并對制備的5-FU復乳微球進行了考察。

1 實驗部分

1.1 實驗材料與儀器

聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA），相對分子質量為30000，單體比50∶50，濟南岱罡生物科技有限公司；二氯甲烷，分析純，天津大學科威新材料科技開發公司；泊洛薩姆188，藥用級，山東聊城安信藥用輔料有限公司。

JD 100-3多功能電子天平，沈陽龍騰電子有限公司；765紫外-可見分光光度計，上海精密儀器科技有限公司；XW-80A型旋渦混合器，上海醫科大學儀器廠；85-2型數顯恒溫磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；HZS-H超級恒溫水浴振蕩器，哈爾濱市東聯電子科技開發有限公司；DT5-6型臺式離心機，北京時代北利離心機有限公司；SCIENTZ-ΠD型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；BT-1600圖像顆粒分析系統，丹東市百特儀器有限公司；ALPHA 1-2冷凍干燥機，德國 CHRIST公司。

1.2 初乳和復乳制備

將適量5-FU加入 NaOH水溶液中，作為內水相，將其加入含 PLGA的二氯甲烷油相中，超聲1 min，制得初乳。將初乳加入1%泊洛薩姆水溶液中，190 Hz超聲1 min，制得復乳，繼續攪拌使二氯甲烷揮發。2500 r/min離心10 min收集微球［12-14］。用蒸餾水洗滌后再次離心。移去上清液后，取下層沉淀物，真空冷凍干燥，即得5-FU PLGA微球。

1.3 復乳穩定性的初步研究

復乳界面上的乳化劑容易在油相中遷移而重新分配，影響復乳穩定性。本研究采用單因素實驗考察第一相體積比（內水相與油相）、第二相體積比（第一相與外水相）對復乳穩定性的影響。首先固定內水相的體積，按照1.2項下制備工藝，設定內水相、油相體積比分別為2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶4，855 Hz超聲1 min，制得初乳。再向初乳中加入適量泊洛薩姆水溶液，設定初乳與外水相的體積比分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4和1∶5，380 Hz超聲 1 min，制得復乳。將初乳和復乳分別離心，測定離心管中的總物料體積及析出的連續相體積，用離心后的乳層保留率評價其穩定性［15-17］。乳層保留率［18-20］的計算見式（1）。

1.4 處方與制備工藝優化

1.4.1 評價指標的確定

以包封率為評價指標，優化微球處方和工藝。通過紫外分光光度計測定殘留水層中5-FU的吸光值，由標準曲線求出5-FU的含量，計算包封率，見式（2）。

標準曲線的制備：精確稱取5-FU 20.02 mg，用0.1 mol/L NaOH溶液溶解并定容，作為母液。將母液稀釋配制成 4.00、8.01、10.01、12.01、14.01 和16.02μg/mL一系列標準溶液，測定其在266 nm處的吸收值，以濃度（C）為橫坐標、吸光值（A）為縱坐標制備標準曲線并進行線性回歸，得回歸方程：A=0.03317C+0.05451，r2=0.9991。結果表明 5-FU濃度在4.00～16.02μg/mL范圍內線性關系良好。

1.4.2 工藝參數的優化

在單因素考察的基礎上，以包封率為評價指標，選擇攪拌溫度（A）、攪拌時間（B）、PLGA在有機相中濃度（C）、輔料濃度（D）4個因素，每個因素選擇3水平，按 L9（34）正交試驗設計表設計 9組實驗，篩選最適宜處方組成和制備工藝。

1.5 微球質量考察

1.5.1 形態與粒度

取1滴微球混懸液滴到載玻片上，顯微鏡下采集圖片并用BT-1600型圖像顆粒分析儀分析微球的形態、粒徑及其粒度分布。

1.5.2 包封率和載藥量

精密稱取10.03 mg微球溶于0.5mL二氯甲烷中，完全溶解后加入4.5mL NaOH溶液并混勻，然后14500 r/min離心10 min除去載體材料，取上清液并用生理鹽水（pH值為7.4）稀釋10倍。用紫外分光光度計測定藥物吸光值，以標準曲線計算5-FU含量，進而計算包封率和載藥量，見式（3）。

1.5.3 體外釋放

本實驗采用恒溫水浴振蕩器，精密稱取20.02 mg微球置于準備好的透析袋中，往透析袋中加5mL生理鹽水，放于含有45mL生理鹽水（pH值為7.4）的錐形瓶中，控制溫度為37℃，轉速為100 r/min，分別于 30 min、1、2、3、4、5、10 和24 h 等時間點取5mL釋放介質于西林瓶中，補加同體積的同溫生理鹽水，在266 nm處測定吸光值。其中第n個點的累積釋放率見式（4）。

其中m為所加樣品中藥物質量，Cn為第n個點的藥物濃度。

2 結果與討論

2.1 復乳的穩定性考察

2.1.1 第一相體積比的考察

第一相的制備過程中未使用乳化劑，內水相與油相體積比對5-FU初乳穩定性的影響見表1。

由表1可知，隨著內水相體積減小，初乳的穩定性先提高后降低，這是因為內水相體積過大時，油膜相對較薄，不能對內水相起到足夠的保護作用，乳滴容易破裂，穩定性差。當內水相與油相的體積比減小到1∶2時，穩定性最好。體積比繼續減小，有效油相流動性增強，使初乳穩定性降低，故最適宜第一相體積比為1∶2。

表1 第一相體積比對初乳穩定性的影響Table 1 Influence of the first phase volume ratio on the stability of primary emulsion

2.1.2 第二相體積比的考察

第二相的制備過程中以泊洛沙姆作為乳化劑，初乳與外水相體積比對復乳的穩定性結果見表2。

表2 第二相體積比對復乳穩定性的影響Table 2 Influence of the second phase volume ratio on the stability of double emulsion

由表2可知，隨著初乳相與外水相的體積比降低，復乳的穩定性下降。這是由于初乳體積分數較小時，乳液的黏度較小，不利于穩定；初乳體積分數逐漸增大，體系黏度增大，甚至表現出凝膠狀態，復乳穩定性提高，但是流動性較差，且容易聚結、轉相，使復乳的結構破壞；當初乳與外水相的體積比接近疏堆積的相體積分數時，乳液最穩定［19］。故為得到相對穩定的復乳微球，選擇最適宜第二相體積比為1∶1。

2.2 處方制備與工藝優化

2.2.1 因素水平的確定

在預實驗中單因素考察的基礎上，第一相體積比為1∶2，第二相體積比為1∶1。選定攪拌溫度（A）、攪拌時間（B）、有機相載體材料濃度（C）和輔料濃度（D）為正交設計考察的因素。因素水平表見表3。

2.2.2 工藝參數的優化

采用L9（34）正交設計表安排9組實驗，以包封率為評價指標，考察各因素對指標的影響，確定最優處方。正交試驗結果見表4。極差越大，表明各因素的影響越大。由此可知各因素對微球包封率的影響程度排序為A＞D＞C＞B。

由表3可知，攪拌溫度對微球包封率的影響最大。隨著外水相溫度的升高，微球粒徑有減小的趨勢，原因可能是高溫使分散相的黏度降低，有利于O/W乳滴的分散。升高溫度，可加快溶劑揮發，微球包封率提高，結果與文獻報道一致［21］。但是高溫過高時，微球表面快速固化，易產生孔洞，導致包封率降低。

表3 因素水平表Table 3 Factors and levels

輔料的濃度在微球的穩定性過程中有一最佳值0.5%。當溶液中泊洛沙姆的濃度增大時，表面張力不斷下降，有利于藥物包封率的提高。若繼續增大泊洛沙姆的濃度，其達到一定值后對微球質量影響不大，此時乳化劑分子在水溶液中可能會形成球狀和棒狀膠團，不再起到更好的乳化效果。

隨著藥酯比的增加，微球的包封率有增大趨勢。但是當藥物量超過其在二氯甲烷中的飽和濃度時，過量的藥物形成沉淀不會被包入微球中。制備時間對微球粒徑的影響最小。原因可能是微球表面的快速固化阻礙了藥物向外水相的流失，因此即使延長固化時間，也不會有藥物泄露。

制備微球的最適宜因素水平組合為：A1-B3-C2-D2，即攪拌溫度10℃、攪拌時間6 h、PLGA在有機相中濃度為15%、輔料濃度為0.5%。

表4 正交實驗設計結果Table 4 Results of orthogonal design

2.3 微球質量考察

2.3.1 形態與粒徑

按優選處方制備微球，所得微球為乳白色粉末狀。目測凍干微球色澤為白色，顏色均勻，無花斑，表面光滑細膩，較疏松，流動性良好，再分散性良好。將微球溶于蒸餾水中，制成混懸液，滴1滴于載玻片，分布均勻，用BT-1600型圖像顆粒分析儀分析微球形態。放大5倍，見清晰的復乳照片，如圖1。

圖1 微球的照片及放大5倍后微球的照片Fig.1 Figures of the microspheres and（×5）of microspheres

粒度分布結果和微球圓形度見圖2和圖3。

圖2 微球的粒徑分布Fig.2 The particle size distribution of the microspheres

圖3 微球的圓形度Fig.3 The sphericity of the microspheres

由結果可知，最適宜處方的平均粒徑為5.05μm，圖2中顆粒數目 477，最大顆粒 60.39 μm，最小顆粒0.83μm，圓形度0.72，長徑比1.29。由此可見，優選處方的微球圓整度較好，且粒徑較均勻。

2.3.2 包封率和載藥量

按照優選的處方制備3批微球，包封率和載藥量結果見表5。

表5 微球的包封率和載藥量Table 5 Entrapment efficiency and drug loading of microspheres

由表5可知，最適宜工藝制備的5-FU PLGA微球重現性較好，平均粒徑5.20μm，載藥量5.34%，包封率為77.22%。

2.3.3 體外釋放

微球體外釋放結果見圖4。

圖4 微球體外釋放曲線Fig.4 The in vitro release profile of microsphere

微球在0.5 h的釋藥率為6.89%，不存在明顯的突釋現象。微球在48 h內釋藥速度相對較快，釋放了約50%的藥量，之后釋藥速度變慢。20 d的累積釋放率為87.03%，而原藥10 h已釋放完全，表現出明顯的緩釋效果。

分別按零級、一級、Higuichi方程擬合釋藥行為，經回歸處理得直線方程：

擬合結果表明微球體外釋放行為較符合Higuchi模型，這與有關文獻的報道［22-23］一致。

3 結論

本研究采用復乳溶劑揮發法制備5-FU-PLGA微球，采用單因素試驗和正交設計考察處方與制備工藝對復乳穩定性和微球質量的影響。結果表明第一相體積比1∶2、第二相體積比1∶1時，可制備相對穩定的微球。PLGA濃度為15%、輔料濃度為0.5%、攪拌溫度為10℃，攪拌時間為6 h時，制備的微球重現性好，粒徑均勻，圓整度好，平均粒徑5.20μm，包封率在70%以上。微球體外釋放實驗顯示釋放行為符合Higuchi模型，具有較好的緩釋特性。與文獻［22-23］中制備的微球比較，本研究制備的微球粒徑更?。?.20μm），可進一步制成注射劑等，具有更廣泛的用途。

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