醫學動物替代研究發展現狀研究

衛茂玲

（四川大學華西醫院中國循證醫學中心，四川成都610041，maolingwei@hotmail.com）

醫學動物替代研究發展現狀研究

衛茂玲

（四川大學華西醫院中國循證醫學中心，四川成都610041，maolingwei@hotmail.com）

目的了解我國動物替代研究發展現狀，發現問題，提出對策。方法文獻檢索與定性描述法。以主題、篇名或關鍵詞“動物替代”或“動物減少”或“動物優化”精確檢索中文醫學常用數據庫中國知網、維普數據和萬方數據庫，補充查找相關研究參考文獻。納入分析組織建設、立法、醫學教育和替代研究方法文獻，并進行定性描述概括，檢索時間截止2015年7月20日。結果初檢引文219條，文獻發表于1999-2014年，以描述性研究為主。動物替代研究領域包括皮膚刺激、眼刺激毒理學檢測、熱敏試驗和動物模型替代等。替代研究信息交流平臺已建立，部分教師已經在實踐運用替代原則，相關專著已出版，但法規建設和驗證體系滯后，替代研究認識還不樂觀，驗證方法研究不多。結論國內動物替代研究不多，缺乏系統化建設。未來應加強動物替代研究體系研究，重點在立法、政策引導、醫學教育、人才培養和研究方法等。

非動物研究；替代動物檢測；替代動物使用；人性化教育；知識轉化

1　動物替代研究概述

1.1概念與內容

動物替代研究（Nonanimal Alternatives），也叫非動物研究（Nonanimal Research），它是指利用替代活體動物的方法，實現生命科學及其他相關研究的實驗驗證目的。動物替代研究方法的理論代表為3R原則，替代（Replacement）、減少（Reduction）和優化（Refinement）。其主要內容包括：①減少動物的使用數量和時間；②以非動物模型來替代動物模型的使用；③優化動物的使用方法，以減少給動物帶來的疼痛和不適等。

1.2分類

按研究范圍分，動物替代主要包括動物檢測替代（Animal Testing Alternatives）和動物使用替代（Animal Use Alternatives）。①動物檢測替代：在程序方面，以體外檢測方法代替動物整體檢測，如組織培養技術和數學模型等，提倡科學研究或實驗室診斷中使用替代動物的檢驗方法。②動物使用替代：在研究、檢驗和教育中使用替代動物的方法，以達到相同目的。按實驗動物替代的層次分為：非生物替代，如以數理化、計算機等方法替代；發育較低的動物替代較高動物，如魚、昆蟲等替代；減少型替代，實驗動物使用數量和時間；優化型替代，若確實要進行動物實驗且沒有其他替代方法，注意優化實驗程序，包括動物飼養、運輸、麻醉、實驗全過程、實驗結束及尸體處置等。

1.3動物實驗替代方法的驗證和批準程序

一種新的動物實驗替代方法的誕生需經過建立、優化、驗證、評估和管理審批等程序。①替代方法的建立，要求必須具有一定的科學性、可靠性、有效性、可操作性和經濟性以及應用價值；②研究方案的優化，其結果能夠較好地預測受試物的體內生物學；③多個實驗室驗證：即在不同時間和地點驗證替代方法的相關性、可信性和重復性等；④同行評價，獨立評估替代方法的科學有效性、經濟性、與特定目的適用性、倫理性等；⑤提交國家和國際專門管理機構審核，按照相關標準審核同意后，方可在實踐中推廣應用。

1.4開展動物替代方法研究的必要性

開展動物替代研究，具有社會倫理、經濟、人文教育和科學性等多重價值。首先，它順應社會倫理發展需求。其次，可減少大量不必要的實驗動物經費。第三，助推醫學實驗教學趨向更加人性化、創新高效的模式發展。第四，促使實驗設計更加合理，在科學有效性方面與人類疾病的相關性更好，直接、省時，避免動物模型在人體疾病預測方面的困難和不精確性，有利于醫學研究成果迅速向實踐轉化。

2　國外動物替代研究起源與發展現狀

2.1國外動物替代研究起源、發展

國外替代研究起源于英國。1954年Charles Hume最先提出3R原則，Russell&Burch于1959共同代表《人性化的實驗技術原則》（The Principles of Humane Experimental Technique），被公認為當前該領域早期代表作。20世紀70年代，英國Dr Hadwen Trust基金和FRAME（Fund for Replacement Animal in Medical Experiments）基金為傳播3R原則、推動歐洲動物替代研究發展做出了重要貢獻。FRAME實驗室1991年成立于英國諾丁漢大學醫學院，主研急性毒性測試，如替代兔眼刺激試驗方法等，該實驗室許多研究已被當作毒性測試動物替代研究的主流發現。實驗室使用的細胞來源于人體組織，而非塑料表面單層生長細胞，可復制人類生活環境的相關發現。目前細胞模型包括人體肝臟、骨骼肌、脂肪組織和皮膚，并創辦雜志Alternatives to Laboratory Animals（ATLA）。2013年1月16日，由英國倡導，全球首個教育和研究協作組啟動，呼吁全球科學家共同來發現、使用動物替代的方法，尋求更加符合倫理、與人類相關的治療措施研究、動物替代驗證方法，被視為醫學動物替代研究發展的一個重要里程碑［1］。

2.2機構建設

全球替代研究組織機構主要集中在英國、美國和歐洲經濟發達國家和地區。據毒性測試非動物方法網站ALTTOX最近更新信息，截至2015年10月19日，歐洲替代研究機構有47個，主要分布在英國、德國、荷蘭、法國、意大利、比利時、瑞士、瑞典、丹麥、挪威、葡萄牙等。美國替代研究組織有24個，亞太地區和南美等國家動物替代研究機構包括澳大利亞、巴西、加拿大、日本和韓國等［2］。

2.3醫學人性化替代教育

歐洲人性化教育網絡（EuroNICHE）創建于1988年，2000年更改為國際人性化教育網絡（The International Network for Humane Education，InterNICHE），倡導并推動全球學生、教師和動物運動者，努力在生物科學、醫學和獸醫學教育中使用動物替代研究方法［3］。美國國家反活體解剖學會（The National Anti-Vivisection Society，NAVS），致力于構建包括課堂內外、對所有生物的同情、尊重和公正的世界，結束科學界對動物的濫用。在尊重倫理、科學和法律基礎上，通過對大量殘忍活體解剖和浪費等活動的宣傳教育，提高公眾對動物實驗替代方法的意識和積極尋找解決方案，推進人性化科學，支持研發使用替代動物產品，通過協作者個人和團體努力，幫助動物免除不必要的痛苦和傷害。開設生物學教育發展項目BioLEAP，為那些不愿意參加解剖實驗課的學生提供豐富的教育資源，利用21世紀教學工具，幫助老師和學校尋找介紹解剖課的替代品，提高學生對解剖、生理和生命科學的理解。在協會網站上還提供有成本效果和人性化的動物替代教室鏈接，以及保護學生擁有選擇使用替代解剖課程、法律和政策權利的相關信息［4］。

2.4立法建設

美國替代方法驗證協調委員會（The Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods，ICCVAM）成立于1997年，評估減少動物急性毒性測試，設計減少動物使用限定在較窄范圍的起始劑量［5］。歐盟2007年6月1日起實施化學品監管體系，法規名稱為《化學品的注冊、評估、授權和限制》（REGULATION concerning the Registration，Evaluation，Authorization and Restriction of Chemicals），簡稱REACH法規。旨在保護人類健康和環境安全，保持和提高歐盟化學工業競爭力，研發無毒無害化合物的創新能力，增加化學品使用透明度，促進非動物實驗，追求社會可持續發展等。

歐盟是第一個實現禁止化妝品動物試驗立法地區，巴西、以色列、印度等國參考歐盟立法，制定了本國禁止化妝品動物試驗立法。

2.5替代方法研究成果

據毒性測試非動物方法網站ALTTOX信息，至2014年9月30日，已有20個專題93項替代方法獲得認可，包括：急性哺乳動物毒性、血液、吸入、殺蟲劑急性毒性檢測、生物和疫苗、腫瘤基因、慢性毒性、皮膚吸收/滲透、生態毒性、內分泌活性替代物、眼腐蝕、刺激、遺傳毒性、光毒性、臨床前和非臨床藥物研發安全性研究（協調指導可減少動物使用）、熱源檢測、生殖與發育毒性、皮膚腐蝕、刺激、過敏等［5］。

2013年，美國哈佛大學Wyss研究所和AstraZeneca團隊使用一種芯片上的組織（organs-onchips）——一種微縮型的人類組織，由明確、可變多聚體，包含有少量導管，連接著人類活細胞，該芯片半透明，幫助優化藥物測試，可觀察對動物和人體組織內部作用，通過利用組織芯片來模擬器官的生物功能，為取代傳統的動物實驗提供了可能［7］。

3　我國動物替代研究現狀

筆者通過文獻復習法，以主題、篇名或關鍵詞“動物替代”或“動物減少”或“動物優化”精確檢索中文醫學常用數據庫中國知網、維普數據和萬方數據庫，補充查找相關研究參考文獻。納入分析組織建設、立法、醫學教育和替代研究方法文獻，并進行定性描述概括，檢索時間截止為2015年7月20日。

初步檢出引文219條，主要發表于1999-2014年，發表最早的是王遵瓊在生理學實驗教學中實踐3R原則［8］。替代方法主要研究內容包括：毒理學檢測、化妝品毒性檢測、眼刺激試驗替代方法；動物模型替代，以體外細胞實驗代替整體動物實驗；藥物代謝反應和動物實驗教學等。

3.1國內替代研究組織

廣東出入境檢驗檢疫局2010年成立中國替代方法研究評價中心，建立網站，為中國的替代方法技術、研究和標準搭建了研究信息共享和培訓交流平臺，主要目標包括：宣傳、普及、共享和推廣3R理念和替代方法；輔助科學家和其他人尋求進行替代方法研究；作為網絡信息中心——替代信息、文獻、數據庫、事件和其他咨詢；推動3R原則的認可和體外新替代方法新技術應用；促進國內外動物福利和替代技術的合作交流。北京實驗動物學會2007年成立了實驗動物替代法研究會，并在雜志開設專欄，介紹國外3R研究及其在各學科的應用［9］。

3.2立法與政策規定

中國化妝品動物試驗立法包括：《實驗動物管理條例》（1988年11月14日起施行）、《關于善待實驗動物的指導性意見》（科技部2006年9月13日發布）以及《化妝品衛生規范》（衛生部2007年1月4日印發）等。中國國家食品藥品監督管理總局《關于調整化妝品注冊備案管理有關事宜的通告》規定，自2014年6月30日起，取消國內非特殊用途化妝品強制性動物試驗的要求。國家科技部1997年在《關于“九五”期間實驗動物發展的若干意見》中把對3R研究列為資助重點。值得注意的是，歐洲藥典規定企業在破傷風人免疫球蛋白（HTIG）研制階段應建立與小鼠毒素中和試驗法（TNT）相當的體外免疫學檢測方法，如酶聯免疫吸附法（ELISA），但我國在原液、半成品和成品的效價檢測階段，TNT法仍為法定方法，未能與國際接軌［10］。

3.3國內替代方法教育和出版

在生理學實驗中，教師已開始有意識應用動物替代原則，優化重組實驗課程，開展人性化醫學教育，節省動物消耗和動物經費。例如，王遵瓊等主動采取較小動物平滑肌來代替大動物平滑肌的生理學實驗，減少動物數量，節約經費［7］。還有學者2011年對中國部分地區實驗動物飼養機構及使用情況進行調研，包括高校在校研究生、教師、生物制藥企業職員等專業人員，發現中國實驗動物使用現狀及實驗動物操作人員的實驗動物福利觀并不樂觀［10］。在出版發行方面，已有彭雙清等主編的《毒理學替代法》和程樹軍等主編的《實驗動物替代方法原理與應用》等專著先后出版，對加快我國該領域理論和實踐應用具有重要意義。

3.4國內動物實驗替代方法研究進展

多名學者在進行快速替代方法研究，以代替傳統耗時、耗費的整體動物皮膚刺激過敏和眼刺激試驗等。例如，平皿法雞胚試驗和人體斑貼試驗的結果一致，可用于評價化妝品的皮膚刺激性［11］。利用3T3細胞光毒性試驗評價化妝品光毒性是可行的［12］。利用人皮膚成纖維細胞與鼠尾膠原混合培養模擬真皮層進行細胞活性和細胞因子測定對10種農藥腐蝕性，結果發現人皮膚模型和動物測試結果一致性達到80%［13］。針對細胞來源及個體差異性問題，建議皮膚致敏性檢測模型未來應尋找來源廣、性狀穩定均一、與角質形成細胞構建三維模型復制性強、能體現Langerhans細胞相關功能的免疫細胞；對于終末檢測指標確定，從細胞因子、表面標記物發展到基因表達檢測和細胞信號轉導通路研究，提高檢測靈敏度多種檢測指標組合［14］。采用免疫雞，從雞蛋清中收集提純抗體方法實現減少動物用量目的［15］。張華捷等分別用酶聯免疫吸附法（ELISA）和小鼠毒素中和試驗法（TNT）測定7家企業9批破傷風人免疫球蛋白待檢品效價，發現兩種方法檢測結果一致性和相關性良好［9］。胚胎干細胞生物學特性決定其在藥物研發、藥物篩選過程中具有重要作用，尤其是誘導多能干細胞（hiPS）出現，hiPS可以針對不同人、不同部位進行取材，可以獲得各種類型終末細胞，進行靶組織、靶細胞的毒性評價。構建基于胚胎干細胞的藥物安全性評價模型，可實現藥物研發及安全性評價個性化，提高藥物治療、藥物研發針對性，并且可以避免動物實驗帶來的種屬差異，降低藥物研發費用、縮短研發周期，是藥物大規模篩選的理想平臺［16］。采用綿羊紅細胞（SRBC）體外溶血試驗測定32種化妝品篩選配方或終配方樣品半數溶血濃度，并與家兔眼刺激試驗結果比較。結果表明，32個樣品中有5個樣品具有輕微眼刺激性，其余樣品均無眼刺激性。結果顯示，SRBC溶血試驗可以用于替代化妝品的動物眼刺激試驗［17］。

4　小結

替代研究是隨著科技進步和社會需要而不斷發展，尤其是細胞、組織培養、基因組學、蛋白質組學與代謝組學、計算機模擬輔助評價系統等發展，使得以前需要活體動物進行的研究可以全部或部分利用體外方法實現。我國部分實驗室和研究人員在生物制品、藥品研發、化妝品安全性檢測、體外毒性測試、醫療器械安全性評價等方面進行了相關研究，但與國外替代方法發展相比，相關研究數量、內容、方法和范圍有限，驗證程序尚處于探索階段，工作缺乏系統性，在立法體系、人性化教育和替代方法學研究等方面滯后于國際水平。

為此，有必要借鑒國際動物替代研究先進管理理念和方法技術，成立醫學動物替代研究協作與教育信息資源共享中心。系統發展動物替代方法學研究，設立基金和獎項，喚醒公眾意識，推動各級各類生命科學相關的院校重視人性化的動物替代管理與教學方法，鼓勵動物實驗替代方法研究及培訓，建立醫學實驗替代方法研究數據庫，提供人性化的動物替代教學資源，保護學生擁有選擇替代解剖課的權利，推動非動物實驗立法，推動創新、人性化生命科學研究策略和人才培養模式，促進科研成果迅速向實踐轉化，促進人與自然、環境、生態和社會健康可持續發展。

［1］World＇s First for Animal Replacement Science Announced［EB/OL］.（2013-01-16）［2015-10 -30］.http：//www.drhadwentrust.org/latestnews/news-and-views/post/171-worlds-first -for-animal-replacement-science-announced.

［2］Organizations&Associations［EB/OL］.（2015-10-23）［2015-10-30］.http：//alttox.org/resource-center/organizations-associations/.

［3］About InterNICHE.［EB/OL］.（2013-01-20）［2015-10-30］.http：//www.interniche.org/ en/about.

［4］Biology Education Advancement Program—BioLEAP［EB/OL］.（2015-09-27）［2015-10-30］.http：//www.navs.org/education/animals-in-education.

［5］Table of Validated&Accepted Alternative Methods［EB/OL］.（2015-09-27）［2015-10-30］. http：//alttox.org/mapp/table-of-validatedand-accepted-alternative-methods/.

［6］AstraZeneca，Wyss Institute To Develop Animal Organs-on-Chips［EB/OL］.（2015-09-27）［2015-10-30］.http：//www.dddmag.com/ news/2013/10/astrazeneca-wyss-institute-develop-animal-organs-chips.

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〔修回日期2016-02-03〕

〔編輯吉鵬程〕

Study on the Current Status of Medical Alternative Animal Researches

WEI Maoling
（Chinese Cochrane Centre，West China Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China，E-mail：maolingwei@hotmail.com）

Objective：To investigate the current status of alternative animal researches in China and thus find the problems and put forward countermeasures.Method：This study was carried out by the methods of literature search and qualitative description.The authors precisely searched the medicine databases commonly used in China（CNKI，VIP，and Wanfang Data）using the MeSH word，title，or keyword namely"animal alternative"，"animal decrease"or"animal optimization"，and added to find the related researches＇references.Then the author included the literature regarding to the organization construction，legislation，medical education，and alternative research methods，and conducted a qualitative description.The deadline was July 20，2015.Results：There were 219 initial quotations published from 1999 to 2014，and mainly were descriptive researches.The fields of alternative animal researches included skin and eye stimulating toxicology test，thermal hyperalgesia and animal model replacement，and etc.The information communication platform of replacement researches had established，part of teachers were in practice using the substitution principle，the related monographs had been published，but the law and regulation construction and validation system were lag，the cognitive of replacement researches was not optimistic，and the validation method researches were insufficient.Conclusion：The domestic alternative animal researches were insufficient and lacking of systematic construction.It should strengthen the study on alternative animal research system，focused on legislation，policy leading，medical education，talent cultivation，and research methods.

Non-animal Research；Alternative Animal Test；Alternative Animal Use；Humanistic Education；Knowledge Translation

R-052

A

1001-8565（2016）02-0304-04

2015-12-27〕