wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白在卵巢癌中的改變

戴朦，沈國棟，王俊，胡世蓮，沈干

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院老年病科，合肥 230001；2.腫瘤免疫與營養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.安徽省保健委員會(huì))

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·綜述·

wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白在卵巢癌中的改變

戴朦1,2，沈國棟1,2，王俊3，胡世蓮1,2，沈干1,2

(1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院、安徽省立醫(yī)院老年病科，合肥 230001；2.腫瘤免疫與營養(yǎng)治療安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3.安徽省保健委員會(huì))

wnt/β-catenin信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已成為近年來研究的熱點(diǎn)。wnt/β-catenin信號(hào)通路可以調(diào)控卵巢細(xì)胞的增殖、分化及惡性轉(zhuǎn)化，由此介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。研究顯示，細(xì)胞膜上、胞質(zhì)胞核內(nèi)、細(xì)胞間及細(xì)胞外影響wnt/β-catenin通路蛋白的改變?cè)诼殉舶┬纬芍衅鹬匾饔?。我們需要研究出更多在wnt/β-catenin通路中起關(guān)鍵作用的蛋白，并以此為靶標(biāo)進(jìn)行卵巢癌的治療，將有助于研發(fā)出更加有效的治療方案。

卵巢腫瘤；Wnt信號(hào)通路；干細(xì)胞

卵巢惡性腫瘤是當(dāng)前病死率最高的婦科惡性腫瘤之一，約90%為上皮性卵巢癌。上皮性卵巢癌有多種組織學(xué)亞型，包括漿液性、子宮內(nèi)膜樣、透明細(xì)胞樣及黏液性卵巢癌。根據(jù)2015年全球統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌每年約有24萬新發(fā)病例，15萬死亡病例，其病死率高達(dá)63%[1]。導(dǎo)致高死亡率的一個(gè)主要原因是超過70%的卵巢癌患者早期缺乏明顯的臨床癥狀及有效的診斷方法，確診時(shí)已為晚期[2]。盡管我們知道卵巢癌的組織類型有很多種，以及對(duì)卵巢癌細(xì)胞的起源存有爭(zhēng)議，但臨床上一般均采用手術(shù)切除聯(lián)合化療作為卵巢癌的一般治療方法[3]。近年來，以紫杉醇/鉑類為基礎(chǔ)的化學(xué)療法和腹腔內(nèi)化學(xué)療法及劑量密集化療法的運(yùn)用，雖提高了晚期卵巢癌患者的總體生存率，但其耐藥、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)情況仍然比較多見，因此我們有必要尋找一個(gè)新的治療模式。已有證據(jù)證明wnt信號(hào)通路在卵巢組織的胚胎發(fā)育和卵巢細(xì)胞增殖、分化及惡性轉(zhuǎn)化過程中起重要作用[4]，因此本文主要對(duì)研究得最多且相關(guān)機(jī)制解釋得較為清楚的經(jīng)典wnt通路進(jìn)行詳細(xì)闡述。

1　經(jīng)典wnt通路的組成及其機(jī)制

經(jīng)過多年研究，目前認(rèn)為wnt通路的主要組成為：Wnt信號(hào)蛋白、胞膜受體FZD家族、胞漿內(nèi)β-catenin、Dsh、APC、GSK3β等蛋白分子、細(xì)胞核內(nèi)TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族等[5]。Wnt通路激活的重要標(biāo)志是β-catenin于胞質(zhì)穩(wěn)定表達(dá)及核內(nèi)定位。當(dāng)沒有wnt配體或受體被封閉時(shí)wnt通路關(guān)閉，β-catenin就被由Axin、APC和GSK3β組成的降解復(fù)合物磷酸化。磷酸化后的β-catenin 再經(jīng)泛素化后進(jìn)一步被送進(jìn)蛋白酶體,最終在那里被迅速降解破壞。而當(dāng)Wnt 與7 次跨膜卷曲蛋白Frizzled(Fzd)以及共同受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)結(jié)合后，wnt通路打開，散亂蛋白Dishevelled(Dsh)在有Wnt 信號(hào)時(shí)激活而被Frizzled磷酸化。Dsh是細(xì)胞膜相關(guān)Wnt受體復(fù)合物的關(guān)鍵成分，它被激活后可抑制降解復(fù)合物活性，使β-catenin 不能磷酸化，避免泛素及蛋白酶體對(duì)其識(shí)別及降解，這樣β-catenin 在胞質(zhì)內(nèi)得以穩(wěn)定存在。而后積累并轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與核轉(zhuǎn)錄因子TCF /LEF 結(jié)合并促進(jìn)特定靶基因如C-myc、Survivin、VEGF 等的啟動(dòng)子暴露，使其激活并表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和遷移，從而參與腫瘤的發(fā)生[6]。

2　wnt通路相關(guān)蛋白在卵巢癌中的改變

2.1細(xì)胞膜因素wnt通路活化的第一個(gè)事件是wnt配體與FZD和LRP5/6的結(jié)合。Fzd受體的兩種亞型Fzd1和Fzd5在上皮性卵巢癌中是增加的，且Fzd5陽性的腫瘤患者6年生存狀況要差于Fzd5陰性患者[7-8]。另外，還有幾種蛋白在wnt通路中充當(dāng)拮抗劑的作用，這些蛋白包括：分泌Fzd受體蛋白家族(SFRP1-5)、Dikkopf家族(DKK1-4)以及wnt抑制因子(WIF-1)等。SFRP5是wnt的拮抗劑，因啟動(dòng)子高度甲基化而表達(dá)減少。Su等發(fā)現(xiàn)，在4種卵巢癌細(xì)胞系(SKOV3,A2780s,OVCAR3 和CP70)中都存在SFRP5的甲基化，而在給予DNA酶甲基化抑制劑5-Aza-CdR (DAC)后，SFRP5的mRNA表達(dá)水平增加，說明SFRP5的沉默是由SFRP5甲基化引起的。SFRP5的后天沉默會(huì)導(dǎo)致wnt通路的癌性活化并通過TWIST介導(dǎo)的EMT和AKT2信號(hào)途徑引起卵巢癌的進(jìn)展和化療耐藥。亦發(fā)現(xiàn)SFRP4[9]在卵巢癌中及SFRP1和SFRP2[10-11]在其他癌中有同樣的作用；DKK2也是wnt的拮抗劑，Jing Zhu等在體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)都證實(shí)了DKK2過表達(dá)會(huì)抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲。將DKK2轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其wnt通路下游靶基因β-catenin、TCF、c-Myc和cyclinD1的表達(dá)都減少。DKK-1，-2，-4都可作為wnt/β-catenin通路的拮抗劑通過結(jié)合LRP5/6阻止LRP5/6與FZD的作用[12]。與結(jié)合wnt共受體的DKK家族其他成員不同，DKK3 可能通過抑制β-catenin的核定位以抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路[13]；Jia等[14]對(duì)比卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶發(fā)現(xiàn)CXCR4表達(dá)水平不同。CXCR4是間質(zhì)細(xì)胞起源的生理性趨化因子受體，敲低CXCR4可以明顯降低卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲及抑制wnt靶基因和vimentin、SLUG等間質(zhì)標(biāo)志分子的表達(dá)，說明CXCR4可以成為卵巢癌患者潛在的一個(gè)預(yù)后因素。

2.2胞質(zhì)和胞核因素先前的研究證實(shí)，子宮內(nèi)膜樣卵巢癌經(jīng)常發(fā)生CTNNB1基因的突變,約占40%。CTNNB1基因編碼的是wnt信號(hào)通路的一個(gè)關(guān)鍵成分，即β-catenin。CTNNB1基因的錯(cuò)義突變影響β-catenin的NH2末端調(diào)節(jié)域，使其不被降解復(fù)合物降解。β-catenin聚集后轉(zhuǎn)向核內(nèi)與TCF/LEF蛋白結(jié)合并激活靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-MYC,CCND1/cyclinD1,PPARδ,gastrin,Cx43 (connexin 43),WISP-1,WISP-2及MMP-7。盡管β-catenin降解的主要機(jī)制在于CTNNB1基因的突變，但是也可以由APC、AXIN1和 AXIN2基因突變引起；Hendrix等對(duì)有無wnt/β-catenin通路調(diào)節(jié)異常的原發(fā)性子宮內(nèi)膜樣卵巢癌進(jìn)行基因芯片和定量PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)wnt通路異常的卵巢癌其成纖維細(xì)胞生長因子9(FGF9)的表達(dá)量是無wnt通路異常卵巢癌的6倍多。β-catenin/TCF介導(dǎo)的FGF9轉(zhuǎn)錄激活依賴于一種新蛋白的合成，四羥基他莫昔芬則可以誘導(dǎo)新融合蛋白β-catenin-S33Y-ER的合成使FGF9轉(zhuǎn)錄增加并促進(jìn)腫瘤形成和侵襲。用新融合蛋白抑制劑放線菌酮可以有效阻斷這種作用，說明FGF9是wnt信號(hào)通路間接的轉(zhuǎn)錄靶基因；Hendrix等[15]通過組織芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)編碼一個(gè)同源序列轉(zhuǎn)錄因子的MSX2(也叫HOX-8)高度表達(dá)。Wnt3a配體或GSK3β抑制劑可激活wnt通路使MSK2表達(dá)升高，而TCF4顯性失活使MSK2表達(dá)降低。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明β-catenin/TCF可以使MSX2通過結(jié)合TCF結(jié)合原件直接調(diào)控MSX2的表達(dá)。用shRNA敲低MSX2可以抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。也有研究報(bào)道在其他癌細(xì)胞中MSX2也有這個(gè)作用[16]。

2.3細(xì)胞間相互作用EMT的發(fā)生是以E-cadherin、細(xì)胞角蛋白等上皮性標(biāo)志物表達(dá)下調(diào)，Vimentin、N-cadherin 等間葉性標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)為特點(diǎn)。與大多數(shù)上皮細(xì)胞起源的腫瘤不同，卵巢表面上皮惡性轉(zhuǎn)化和腹腔轉(zhuǎn)移時(shí)伴隨著E-cadherin表達(dá)的增加。大多數(shù)正常上皮表達(dá)高水平的E-cadherin，但間質(zhì)起源的正常卵巢上皮卻很少表達(dá)這種蛋白，它主要表達(dá)的是N-cadherin。上皮性卵巢癌有一個(gè)特征，在低分化卵巢癌中E-cadherin表達(dá)增加，在晚期腫瘤及腹水腫瘤細(xì)胞中表達(dá)減少[17]。啟動(dòng)EMT標(biāo)志之一是經(jīng)典wnt信號(hào)通路的激活，wnt信號(hào)通路能通過抑制糖原合成酶激酶3β(GSK3β)介導(dǎo)的磷酸化作用以及抑制胞質(zhì)中的β-連環(huán)蛋白(β-catenin)降解等作用來誘發(fā)EMT轉(zhuǎn)換。胞內(nèi)大量增加的β連環(huán)蛋白會(huì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入核內(nèi)，作為轉(zhuǎn)錄因子亞單位誘導(dǎo)大量基因的表達(dá)，這些靶基因的表達(dá)產(chǎn)物中有很多都是能夠誘導(dǎo)EMT轉(zhuǎn)換過程的轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，癌細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)發(fā)生EMT后可增強(qiáng)對(duì)化療藥物的抗藥性且獲得干細(xì)胞的特征，因而抑制EMT的發(fā)生，為潛在的特異性腫瘤干細(xì)胞治療開辟了道路。

轉(zhuǎn)移性卵巢癌上皮細(xì)胞在腹腔內(nèi)播散，通過整合素粘附于間質(zhì)膠原纖維。整合素增加會(huì)導(dǎo)致E-cadherin內(nèi)在化增多、抑制GSK-3β、增加核內(nèi)β-catenin的水平、增加調(diào)控β-catenin啟動(dòng)子的活化及wnt/β-catenin靶基因轉(zhuǎn)錄活性。Cox2,尿激酶型纖溶酶原激活物受體(uPAR),vimentin,LRP6,Wnt5a,MMP-9和Snail表達(dá)增加。Burkhalter等發(fā)現(xiàn)一個(gè)TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，它是β-catenin和TCF4的多肽抑制劑，通過結(jié)合β-catenin阻礙其與TCF4的結(jié)合以抑制核內(nèi)β-catenin的信號(hào)。將其轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞內(nèi)，發(fā)現(xiàn)比空轉(zhuǎn)的細(xì)胞侵襲能力下降，證明β-catenin/TCF調(diào)控的靶基因?qū)β殉舶┑那忠u有重要作用。

2.4細(xì)胞外因素研究發(fā)現(xiàn)，上皮性卵巢癌wnt通路不只是細(xì)胞上、細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間的成分上調(diào)，細(xì)胞外活化劑也上調(diào)，這些成分特別地包括：wnt-1、wnt2b、wnt-5a、wnt7a和wnt-11。Yoshioka等[18]將正常卵巢組織與卵巢癌組織做比較，通過實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)wnt7a基因的轉(zhuǎn)錄在所有wnt配體中最高并發(fā)現(xiàn)wnt7a只在上皮性卵巢癌中表達(dá)，其他類型不表達(dá)。因此構(gòu)建TCF/LEF Top-Flash熒光素酶報(bào)告基因載體，并將TCF結(jié)合域突變的FOP-Flash作為陰性對(duì)照組，分別轉(zhuǎn)染wnt7a高表達(dá)的SKOV3及HEY細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TCF/LEF Top-Flash熒光素酶報(bào)告基因活性比較高。將wnt7a和Fzd5共轉(zhuǎn)染SKOV3及HEY細(xì)胞，其TCF/LEF Top-Flash熒光素酶報(bào)告基因活性更高，同時(shí)用SFRP2拮抗wnt配體或敲低TCF4可以抑制活性，而只轉(zhuǎn)染FZD5卻不引起報(bào)告基因活性表達(dá)；MMP7為wnt通路的靶基因，wnt7a可激活MMP7啟動(dòng)子引起wnt通路的活化并增加MMP7在卵巢癌的表達(dá)。以上結(jié)果說明wnt7a可通過Fzd5激活wnt/β-catenin通路。

3　wnt/β-catenin通路與腫瘤干細(xì)胞

研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌干細(xì)胞與化療耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)有關(guān)。正常分化的成體細(xì)胞因?yàn)樵鲋尘徛疑芷谳^短，不足以累積惡性轉(zhuǎn)化所需要的多重基因突變。而干細(xì)胞具有自我更新和產(chǎn)生不同種類分化細(xì)胞的能力，其較成體細(xì)胞更易成為腫瘤發(fā)生的靶細(xì)胞，并惡變?yōu)槟[瘤干細(xì)胞。腫瘤是由腫瘤干細(xì)胞無限制自我更新和混亂發(fā)育而成的畸形器官或組織。傳統(tǒng)治療可減小腫瘤體積，但留下來的卵巢癌干細(xì)胞便成為卵巢癌復(fù)發(fā)和難治的根源。腫瘤干細(xì)胞的異常信號(hào)通路主要有wnt /β-catenin、Notch、Hedgehog、HMGA2、TGF-β、PTEN、Bcl-2、CXCR4-SDF-1 等，它們通過各自的機(jī)制以及一定的交互作用對(duì)卵巢癌干細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，并最終導(dǎo)致卵巢癌的轉(zhuǎn)移、化療耐受及復(fù)發(fā)。研究表明，在乳腺癌、皮膚癌、腸癌、肝細(xì)胞癌等腫瘤組織的腫瘤干細(xì)胞中，均存在wnt /β-catenin 信號(hào)通路的過度活化[19]。

4　結(jié)語

已發(fā)現(xiàn)影響wnt通路的胞膜、胞質(zhì)、胞核等蛋白的改變?cè)诼殉舶┑男纬芍衅鹬匾饔?。?duì)這些成分的鑒定給了我們治療的潛在靶標(biāo)。Fzds是結(jié)合wnt配體的膜受體之一，它可以激活wnt通路且在卵巢癌中過表達(dá)；臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)卵巢癌中已知19個(gè)wnt配體中的5個(gè)的上調(diào)可以導(dǎo)致wnt通路活性的增加；β-catenin本身的上調(diào)及組成降解復(fù)合物蛋白的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致核內(nèi)β-catenin的增加，從而增加wnt通路的活性；β-catenin助激活劑的上調(diào)也會(huì)引起靶基因轉(zhuǎn)錄的增加；研究發(fā)現(xiàn)，有23種不同的靶基因的改變可以引起細(xì)胞的增殖，這是核內(nèi)β-catenin積累的結(jié)果，已證實(shí)其在卵巢癌中過表達(dá)。

wnt信號(hào)在上皮性卵巢癌中被激活，有直接通過配體激活通路的上調(diào)和通過與其他通路交聯(lián)而不依賴配體的核內(nèi)β-catenin的增加。前已述及，卵巢癌預(yù)后差主要是因?yàn)樵\斷遲及化療耐藥。卵巢癌在進(jìn)展早期會(huì)向上皮表型轉(zhuǎn)化，因此尋找卵巢癌新的診斷和預(yù)后因子有助于預(yù)測(cè)臨床結(jié)局。由于卵巢癌化療耐藥的具體機(jī)制仍然不清楚，因此有必要尋找一種新的方法來解決，對(duì)信號(hào)通路中調(diào)控化療反應(yīng)的關(guān)鍵分子的識(shí)別將會(huì)有助于研發(fā)出更加有效的治療藥物組合方案。

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Change of the proteins associated with wnt/β-catenin signaling pathway in ovarian cancer

DaiMeng*,ShenGuodong,WangJun，HuShilian,ShenGan

(*DepartmentofGeriatrics,AnhuiProvincialHospitalAffiliatedtoAnhuiMedicalUniversity,Hefei230001,China;AnhuiProvincialKeyLaboratoryofTumorImmunotherapyandNutritionTherap)Correspondingauthor:ShenGan,Email:shenganustc@163.com

The role of wnt/β-catenin Signaling pathway in tumor development has become a hotspot in recent years.Wnt/β-catenin signaling pathway could regulating proliferation,differentiation and malignant transformation of ovarian cells,and therefore mediated tumorigenesis and development.Studies have shown that change of the proteins which affecting wnt/β-catenin pathway on the cell membrane,cytoplasm,nucleus and outside the cell play an important role in the formation of ovarian cancer.More key proteins need to be study in the wnt / β-catenin pathway,and as a target for the treatment of ovarian cancer,which will help develop more effective treatment options.

Ovarian neoplasms；Wnt signaling pathway；Stem cells

安徽省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(1408085MH167)；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目(1301042094)

戴朦，碩士在讀，Email：972087149@qq.com

沈干，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，Email: shenganustc@163.com

R737.31

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.04.035

2015-11-10)