野生二粒小麥后代LMW-GS編碼基因克隆與序列分析

曹　前

（四川省儀隴縣農牧業局，南充　　637600）

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野生二粒小麥后代LMW-GS編碼基因克隆與序列分析

曹前

（四川省儀隴縣農牧業局，南充637600）

通過PCR擴增的方法，從穩定遺傳的野生二粒小麥高世代后代中分離低分子量谷蛋白基因。并且對核苷酸和氨基酸序列進行生物信息學分析，以期為探索SNPs變異在遺傳育種中的特性提供參考，為實現分子層面小麥品質育種奠定理論基礎。

小麥 低分子量谷蛋白 基因克隆 序列分析

野生二粒小麥具有高蛋白質含量、豐富的貯藏蛋白組成等優良性狀，是被期望為全球小麥的可持續生產貢獻其全方位多樣性的優異物種［1］。然而，遺憾的是，其豐富的遺傳多樣性在普通小麥種已被降低達70%左右［2］。該研究旨在對野生二粒小麥為父本，栽培小麥為母本的遠緣雜種高世代，進行LMW-GS基因的分子克隆和序列分析，探討野生二粒小麥LMW-GS基因向普通小麥的導入與表達能力，篩選具有含有野生二粒小麥LMW-GS的遺傳種質。

1 材料和方法

1.1 材料

（川農16×野生二粒小麥D97）F11的2 n=42的穩定株系7-40、7-209；（川農16×野生二粒小麥D97）F11與內麥9號雜交F2 的株系Q-F2系列；并以親本川農16為對照。

1.2 方法

采用改進2×CTAB方法對小麥葉片進行基因組DNA提取［3］。運用基因組DNA的PCR擴增、轉化、克隆，最后進行測序分析。

2 結果與分析

2.1 LMW-GS基因核酸推導與氨基酸序列分析

保守的N-端區，其基本組成如METSCIPGL，其中SCIPGL部分突變率較高，其決定了小麥LMW-GS屬于何種類型，所克隆的基因序列絕大多數為LMW-m型，包括亞基型有SCIPGL，SCISGL，PCIPGL，PCHPWL，SHIPSL，SRVPGL等6種， 其 中PCHPWL，SHIPSL，SRVPGL極其罕見；LMW-i型亞基出現1次，未見LMW-s型亞基。從而推導這3種類型的LMW-GS谷蛋白亞基在小麥中的分布極不均衡。

重復區較長，多肽類型較為豐富，重復區不含半胱氨酸。所克隆LMW-GS序列的重復區都富含脯氨酸（P）和谷氨酰胺（Q），其主要重復片段有QQFPQQ、QQQPLFQQ、QQPFSQQQ、QQPPFSQQQ、QQPPFLQQQ、PPFSQQQQ、QQQPSFSQQ、PLFSQQQQ等重復單元；該區域的變異程度較高，主要由于重復單元數量不同所致，這也決定了LMW-GS基因長度的變異。

2.2 LMW-GS半胱氨酸殘基（Cys）的數目及位置

LMW-GS家族成員半胱氨酸殘基（Cys）相對保守，一般在8個左右。該研究通過分析LMW-GS蛋白質編碼序列，發現該26個基因中半胱氨酸殘基（Cys）特異性變異出現了6個不同位置共15次由其它氨基酸替換為半胱氨酸（Cys）。發現了6條具有額外半胱氨酸殘基（Cys），具有9個半胱氨酸（殘基Cys）的亞基序列；同時發現2條半胱氨酸殘基（Cys）缺失型亞基序列，來自母本CN16，其Cys殘基缺失了1個。

所獲得的LMW-GS氨基酸序列中，半胱氨酸殘基（Cys）變異在N-端相對較少，只出現了2個半胱氨酸殘基（Cys）被替換的序列；而大部分變異出現在信號肽區和C-端。其中，在信號肽區出現了6個半胱氨酸殘（Cys）基替換其他氨基酸的序列。C-端最為豐富，主要表現為半胱氨酸（Cys）替換其他氨基酸，如半胱氨酸（Cys）替換甲硫氨酸（M）2個、半胱氨酸（Cys）替換精氨酸（R）2個、半胱氨酸（Cys）替換甘氨酸（G）3個。

3 討論

半胱氨酸殘基（Cys）變異對小麥品質影響的可能性推測，該研究克隆出的氨基酸序列中，6個LMW－m型氨基酸序列信號肽區第16位為半胱氨酸（C），其余序列為色氨酸（S），其變異極為罕見；在N－端也出現了半胱氨酸（C）向組氨酸（H）和精氨酸（R）的稀有突變；從氨基酸極性和親水性分析雖不影響信號肽的性質，但不能排除Cys殘基在氨基酸聚合時二硫鍵可能會對蛋白質二級結構起改變作用，從而影響蛋白質構造，進而可能影響小麥的品質。

［1］ gianibelli M C，Larroque O R，MacRichie F，Wrigley C W. Biochemical，genetic，and molecular characterization of wheatglutenin and its component subunits. Cereal Chemstry，2001，（78）：635～646

［2］ Jaradat A. Ecogeography，genetic diversity，and breeding value of wild emmer wheat（Triticum dicoccoides K?rn ex Asch. & Graebn.）Thell. Australian Journal of Crop Science，2011，5，（9）：1 072～1 086

［3］ 顏澤洪. 山羊草屬物種高分子量谷蛋白基因的分子克隆. 四川農業大學博士論文，2001