免疫增強劑提升豬用滅活疫苗免疫效力的研究

唐波，張道華，唐應華，常晨，劉國陽，華濤，張雪花，侯繼波

(江蘇省農業(yè)科學院 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014)

免疫增強劑提升豬用滅活疫苗免疫效力的研究

唐波，張道華*，唐應華，常晨，劉國陽，華濤，張雪花，侯繼波

(江蘇省農業(yè)科學院 國家獸用生物制品工程技術研究中心，南京 210014)

為評價免疫增強劑對豬細小-乙腦二聯(lián)滅活疫苗的免疫效力提升作用，將免疫增強劑以伴侶形式與疫苗共同混合免疫5～6月齡陰性后備母豬和種公豬，檢測其抗體水平。結果顯示，免疫增強劑與疫苗混合免疫后1周抗體全部轉陽，免疫后1～6月平均抗體效價均顯著高于不含免疫增強劑的常規(guī)疫苗組，表明該免疫增強劑能夠顯著提升豬細小-乙腦二聯(lián)滅活疫苗對后備母豬和種公豬的免疫效力。

免疫增強劑；豬細小病毒；豬乙腦病毒；滅活疫苗；免疫效果

豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV) 與乙腦病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)是引起豬繁殖障礙病的重要病原[1-2]。目前國內細小病毒陽性感染率超90%，受感染公豬可通過精液長時間排毒[3]。滅活疫苗仍是目前預防細小感染最有效方法[4-5]。我國預防豬乙腦的疫苗為SA14-14-2弱毒活疫苗，然而在豬群中廣泛接種減毒活疫苗存在著一定風險，而滅活疫苗對解決活疫苗潛在危險具有重要意義[6]。但是滅活疫苗免疫后仍存在抗體水平低和免疫保護期短等問題，如何提升現(xiàn)有滅活疫苗免疫效力成為臨床上急需解決的難題。使用一種既可以增強疫苗免疫效力又可以大大減少抗原含量降低生產成本的免疫增強劑顯的尤為重要。隨著規(guī)模化養(yǎng)豬發(fā)展，迫切需要能一針多防且免疫效果好的聯(lián)苗。研制聯(lián)苗不但可以簡化免疫程序，還可以顯著降低接種應激反應從而提高疫苗整體免疫效果。

機體免疫系統(tǒng)均存在模式識別受體[7]，這些受體能對外來病原的特定小分子物進行識別，繼而激發(fā)機體免疫功能[8]。目前應用比較廣泛的一些天然免疫受體及其激動劑類小分子類物質就是機體免疫系統(tǒng)的高效刺激分子，在機體疫應答過程中發(fā)揮十分重要的作用[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，含天然受體激動劑的復方免疫增強劑能夠有效提升滅活疫苗對雞的免疫效力[11]。本研究對有效提升禽用滅活疫苗免疫效力的VA5復方免疫增強劑進行了研究，以評價其對豬用滅活聯(lián)苗的免疫增強效果。

1 材料和方法

1.1 疫苗和檢測試劑 豬細小、乙腦二聯(lián)滅活疫苗為本室制備，細小病毒含量為每1 mL 107.4TCID50，乙腦病毒含量為每1 mL 107.5TCID50；細小疫苗毒株及HI檢測用抗原為PPV-NJ株，乙腦疫苗毒株為JEV-JS株。豬細小病毒ELISA抗體檢測試劑盒，購自深圳綠詩源生物技術有限公司；豬乙腦病毒ELISA抗體檢測試劑盒，購自武漢科前動物生物制品有限責任公司。

1.2 試驗動物 5～6月齡陰性后備母豬和公豬(豬細小病毒HI抗體陰性)，購自江蘇明天農牧科技公司。

1.3 疫苗的制備 含VA5 免疫增強劑疫苗的配制詳見專利( 申請?zhí)?01210235427.0)。按要求將免疫增強劑配成油乳劑疫苗伴侶，將疫苗伴侶與常規(guī)豬細小、乙腦二聯(lián)滅活疫苗按體積比1︰9混合，該混合液即為含免疫增強劑的豬細小、乙腦二聯(lián)滅活疫苗滅活疫苗。

1.4 抗體水平檢測

1.4.1 豬細小病毒血凝抑制抗體(HI)的檢測 將分離的100 uL血清56 ℃水浴滅活30 min后，加入300 uL 25%白陶土懸液，混勻，置室溫下作用30 min；以10000 r/min離心10 min，吸取上清，加入100 uL 20%的豚鼠紅細胞泥，振蕩混勻后37 ℃作用1 h以4000 r/min離心10 min，收集上清即為待檢血清樣品。參照文獻中[12]HI檢測方法來評價免疫后抗體消長規(guī)律。1.4.2 間接ELISA抗體檢測 將分離待檢血清按照ELISA檢測試劑盒使用說明書的方法進行PPV、JEV ELISA抗體。通過酶標儀讀取OD630值，測定血清樣品ELISA抗體效價，OD630﹥0.32判為陽性。

1.5 疫苗免疫試驗 選健康后備母豬和種公豬各15頭，分別設常規(guī)疫苗免疫組、伴侶疫苗免疫組、空白對照組，每組5頭。免疫組分別每頭2.0 mL肌肉注射，于免疫后1周、2周、3周、4周、2月、3月、4月、5月、6月采血，分別用檢測血清中PPV、JEV抗體。

2 結果與分析

2.1 含免疫增強劑疫苗免疫后備母豬試驗結果

2.1.1 后備母豬PPV HI抗體檢測結果 常規(guī)疫苗免疫組1周后HI抗體部分轉陽(HI抗體不低于6)，2周后全部為陽性，1～3個月HI抗體處于較高水平，至免疫后4～6個月有所下降。含免疫增強劑疫苗免疫組1周后HI抗體全部轉陽，免疫后1～6個月抗體水平均維持在較高水平且明顯高于常規(guī)疫苗免疫組(圖1)。

2.1.2 后備母豬PPV ELISA抗體檢測結果 PPV滅活疫苗免疫后備母豬后的ELISA抗體檢測結果表明，各免疫組免疫后1周ELISA抗體全部轉陽(OD630≥0.32)，第2周后抗體水平均有大幅度的提升。常規(guī)疫苗組免疫后第4個月開始下降，含免疫增強劑疫苗組免疫后1～6個月抗體水平均維持在較高水平。含免疫增強劑組在各個時間段的抗體水平均明顯高于常規(guī)疫苗免疫組(圖2)。

圖1 后備母豬免疫后PPV HI抗體檢測結果

圖2 后備母豬免疫后PPV ELISA抗體檢測結果

2.1.3 后備母豬JEV ELISA抗體檢測結果 免疫后不同時間點分別采集血液分離血清，測定JEV ELISA抗體。結果見圖3，常規(guī)疫苗免疫組免疫后1周ELISA抗體全部轉陽(OD630≥0.32)，3～9周抗體水平維持教高水平，免疫后第3個月開始逐漸下降。而含免疫增強劑疫苗組3周到6個月均能維持在較高水平且在各個時間段的抗體水平均明顯高于常規(guī)疫苗免疫組。

2.2 含免疫增強劑疫苗免疫種公豬試驗結果

2.2.1 種公豬PPV HI抗體檢測結果 公豬在免疫后各個時間段采集的血清進行HA檢測，得到HI抗體水平消長曲線。由圖4可知，常規(guī)疫苗免疫組1周后HI抗體部分轉陽(HI抗體不低于1︰6)，2周后全部為陽性，免疫后4周HI抗體達到峰值，3～6個月有所下降。含免疫增強劑疫苗免疫組1周后HI抗體全部轉陽，免疫后1～6個月抗體水平均維持在較高水平。

圖3 后備母豬免疫后JEV ELISA抗體檢測結果

圖4 公豬免疫后PPV HI抗體檢測結果

2.2.2 種公豬PPV ELISA抗體檢測結果 ELISA檢測PPV滅活疫苗免疫種公豬后各個時間點血清抗體水平。由圖5可知含免疫增強劑疫苗免疫組免疫后1周后很快產生ELISA抗體，免疫后4周HI抗體達到峰值，1～6個月均維持在較高水平。常規(guī)疫苗組各個時間點血清抗體水平則明顯低于含免疫增強劑組。

圖5 公豬免疫后PPV ELISA抗體檢測結果

2.2.3 種公豬JEV ELISA抗體檢測結果 疫苗免疫種公豬后JEV ELISA抗體檢測結果表明，所有免疫組種公豬免疫后免疫1周抗體全部轉陽隨后抗體效價逐步增高。常規(guī)疫苗免疫后第3個月開始逐漸下降。而含免疫增強劑疫苗組免疫后3周至6個月均能維持在較高的水平，抗體水平在各個時間點均顯著高于常規(guī)疫苗免疫組(圖6)。

圖6 公豬免疫后JEV ELISA抗體檢測結果

3 討論與小結

豬細小和乙腦疫苗主要是應用于母豬和種公豬，本試驗將VA5復方免疫增強劑以伴侶形式與疫苗混合分別免疫5～6月齡陰性后備母豬和種公豬。免疫后1周抗體很快全部轉陽，常規(guī)疫苗免疫后第3個月開始逐漸下降，而含增強劑疫苗組免疫后1～6個月抗體水平全部維持在較高水平且顯著高于常規(guī)滅活疫苗。試驗表明該免疫增強劑在后備母豬和種公豬上使用均能很快提升疫苗的抗體效價并能有效延長抗體持續(xù)期。

有研究報道，CpG-ODN受體激動劑和poly(I:C)這類物質能夠增強機體的免疫應答，在機體的免疫應答過程中發(fā)揮著重要作用[13]。本研究使用的VA5復方免疫增強劑中含有這類天然免疫受體激動劑，其在禽流感、馬立克病等滅活疫苗的免疫效力提升上具有十分顯著的作用[14]。該增強劑不僅能夠提高禽流感單苗的免疫效力對禽用二聯(lián)疫苗也同樣具有免疫增強作用，使得機體免疫二聯(lián)苗后比常規(guī)二聯(lián)苗提前產生抗體且效價明顯提升[15]。使用免疫增強劑是目前提升滅活疫苗保護效力的有效途徑。該免疫增強劑對豬用滅活疫苗免疫效力影響以及免疫機理的研究報道尚少。

本試驗中含VA5復方免疫增強劑的豬用聯(lián)苗在免疫豬后不僅可以誘導高水平抗體產生，同時還減少了免疫次數(shù)以及對豬體的應激反應，大大提高生產效率具有良好的推廣應用前景。這為我們進一步開展豬細小-乙腦二聯(lián)滅活疫苗后續(xù)研究奠定基礎。

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(編輯：李文平)

Evaluation of Immunopotentiators for Improving the Efficacy of Porcine Inactived Vaccine

TANG Bo，ZHANG Dao-hua*，TANG Ying-hua，CHANG Chen，LIU Guo-yang，HUA Tao, ZHANG Xue-hua, HOU Ji-bo

(NationalResearchCenterofEngineeringandTechnologyforVeterinaryBiologicals,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences,Nanjing210014，China)

To evaluate the immunopotentiator for improving the efficacy of inactived porcine parvovirus and Japanese encephalitis vaccines, the immunopotentiator was mixed with chaperon form of vaccine. Replacement gilts and boars were inoculated with the vaccine for immunization, and the hemagglutinin inhibition (HI) titer and ELISA of sera were measured. The results showed a high antibody titer of immunopotentiators group were elevated significantly after vaccinated. The immunopotentiator is effective in prolonging the antibody persistence period. The antibody is all positive for one week later, and antibody level were significantly higher than conventional group during six months. In sum, the immunopotentiator can improve the efficacy on porcine inactivated vaccine in replacement gilt and boar.

immunopotentiators；porcine parvovirus；Japanese encephalitis virus； inactivated vaccine；immune effect

江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新基金項目[CX(11)2047]；農業(yè)公益性行業(yè)科研專項(201303046)

唐波，碩士，從事動物分子病原學及免疫學研究。

張道華。E-mail: 2005107058@163.com

2016-03-17

A

1002-1280 (2016) 06-0005-05

S858.28