RP-HPLC雙波長法測定四味穿心蓮散中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量

包愛情，陸春波，林仙軍，陳曉林，蔡文金，金香蓮

(1.浙江省獸藥飼料監察所，杭州311101；2.上藥凱侖醫藥股份有限公司，杭州310000)

RP-HPLC雙波長法測定四味穿心蓮散中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量

包愛情1，陸春波1，林仙軍1，陳曉林1，蔡文金1，金香蓮2

(1.浙江省獸藥飼料監察所，杭州311101；2.上藥凱侖醫藥股份有限公司，杭州310000)

建立了反向高效液相色譜法檢測四味穿心蓮散中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量的方法。試驗采用十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱( 4.6 mm × 250 mm，5 μm) ，以甲醇- 0.2%磷酸溶液梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃；穿心蓮內酯檢測波長226 nm，脫水穿心蓮內酯檢測波長252 nm；穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量測定范圍分別為2.32～37.14 μg/mL(r=1.0000)，2.00～31.94 μg/mL(r=1.0000)；加樣平均回收率分別為99.12%、98.84%；RSD分別為0.60%、0.62%；該方法方便、準確、可靠，適用于測定四味穿心蓮散中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量。

四味穿心蓮散；高效液相法；穿心蓮內酯；脫水穿心蓮內酯；

四味穿心蓮散是以穿心蓮、辣蓼、大青葉、葫蘆茶四味藥材加工制成的中獸藥散劑，具有清熱解毒，除濕化滯的功效，用于瀉痢，積滯等。方中穿心蓮清熱解毒、消腫止痛，為君藥；葫蘆茶清熱解暑、消積利濕、殺蟲，辣蓼祛濕止瀉、散瘀止痛、祛風殺蟲，共為佐使藥。諸藥合用，共奏清熱解毒、除濕化滯之功[1]。穿心蓮，又名春蓮秋柳，一見喜，欖核蓮、苦膽草、金香草、金耳鉤、印度草，苦草等。其中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯為穿心蓮的有效成份，具有祛熱解毒，消炎止痛之功效。穿心蓮內酯更是對細菌性與病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊療效，被譽為天然抗生素藥物[2-3]。《中華人民共和國獸藥典》二○一○版二部(收載了四味穿心蓮散，對穿心蓮進行了薄層鑒別，未對其進行定量分析[4]。本文采用反向高效液相色譜法對四味穿心蓮散中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯含量測定進行了研究。

1 材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，配Waters 2996二極管陣列檢測器，美國Waters公司； XS-205電子天平，瑞士METTLER TOLEDO公司；KQ-500E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試劑與材料 甲醇為色譜純，Merck 公司，其余試劑均為分析純；實驗用水為milli-Q 超純水。穿心蓮內酯對照品(來源：中國食品藥品檢定檢驗院，批號：110797-201108，含量：98.7%)；脫水穿心蓮內酯對照品(來源：中國食品藥品檢定檢驗院，批號：110854-201308，含量：99.7%)。四味穿心蓮散供試品(批號分別為20150901，20150902，20150903)，由浙江A廠生產；四味穿心蓮散供試品(批號分別為20160101，20160102，20160103)，由浙江B廠生產；四味穿心蓮散供試品(批號為20131001D)，由河北C廠生產。自制樣品：中藥飲片購于上藥凱侖醫藥股份有限公司，經浙江省獸藥飼料監察所鑒定，按相應處方自制。

2 方法與結果

表1 梯度洗脫表

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取穿心蓮內酯11.76 mg和脫水穿心蓮對照品10.01 mg，分別置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取20 mL上述溶液于同一50 ml容量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品貯備液。精密量取混合對照品貯備液6.0 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取四味穿心蓮散1 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加40%甲醇25 mL，超聲提取(功率250 W，頻率50 kHz)30 min，過濾，取續濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方比例自配不含穿心蓮的散劑，按其工藝制成陰性對照樣品，再按2.2.2項方法制備成陰性對照溶液。

2.3 系統適應性試驗 分別取混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液注入液相色譜儀，進行全波長掃描，記錄穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的光譜圖(圖1～圖2)；同時記錄混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液的色譜圖(圖3～圖8)。該色譜條件下，穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯分離度良好，與其他峰分離良好，理論塔板數均大于6000。陰性樣品在混合對照品色譜圖相應的位置上無吸收峰，表明處方中的其他成分對測定結果并無干擾，滿足定量檢測需要。峰1為穿心蓮內酯，峰2為脫水穿心蓮內酯。

圖1 穿心蓮內酯光譜圖

圖2 脫水穿心蓮內酯光譜圖

圖3 混合對照品226 nm色譜圖

圖4 混合對照品252 nm色譜圖

圖5 自制陽性樣品226 nm色譜圖

圖6 自制陽性樣品252 nm色譜圖

圖7 自制陰性樣品226 nm波長色譜圖

圖8 自制陰性樣品252 nm色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性范圍 精密量取穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯混合對照品貯備溶液(46.4、39.9 μg/mL)各0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL分別置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件，精密量取10 μL，記錄色譜圖，測定峰面積，以峰面積積分值(Y)對濃度(X，μg/mL)進行線性回歸計算，方程為：

穿心蓮內酯：Y=41467.11X+1698.00

(r=1.0000)，線性范圍2.32～37.14 μg/mL;

韓世玉等[6-11]研究表明，桑樹葉片生長受桑樹種類或品種的影響；黃麗玲等[12-13]研究表明，桑樹葉片生長受氣候條件的影響；許楠等[14-21]研究表明，桑樹葉片生長受施肥水平等栽培管理水平的影響。桑樹新梢與葉片的生長發育動態除受品種等內部因素的影響外，還受氣候、土壤和栽培管理等外部因素影響。在生產中前一年要加強水肥管理，使樹體貯備足夠的養分，滿足次年新梢生長和葉片生長發育的養分需求。同時在新梢和葉片生長發育時期加強水肥管理，為其提供良好的營養條件。因此，在試驗區條件下，合理施用催芽肥對促進桑樹新梢和葉片生長有著重要的作用。

脫水穿心蓮內酯：Y=33757.20X+8960.78

(r=1.0000)，線性范圍2.00～31.94 μg/mL。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL,按上述色譜條件，連續重復進樣6次，記錄峰面積，計算結果，穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯峰面積的RSD分別為0.32%，0.42%。

2.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液(自制樣品)，分別在0、1、2、4、6、8、12、24 h進樣10 μL，記錄色譜峰面積，計算穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的峰面積的RSD分別為0.54%、0.78%。結果表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一批供試品(自制樣品)，分別稱取6份，照2.2.2項下方法制備供試品溶液，測定供試品溶液中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量。結果測得穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量分別為515.3、514.5、515.7、521.0、517.7、516.8 μg/g；脫水穿心蓮內酯的含量分別為339.2、341.8、345.2、345.5、338.3、343.9 μg/g；RSD分別為0.45%、0.24%。結果表明此方法重復性良好。2.4.5 加樣回收率試驗 準確稱取已知含量的四味穿心蓮散樣品(自制樣品) 0.5 g，共6份，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加25 mL對照品溶液(稱取穿心蓮內酯25.23 mg和脫水穿心蓮內酯17.21 mg于同一100 mL容量瓶，甲醇溶解并稀釋至刻度，再精密量取10 mL于250 mL容量瓶中，用40%甲醇稀釋并定容到刻度)，其余按2.2.2項同法處理后，測定并結算回收率，結果見表2。

表2 四味穿心蓮散回收率試驗結果(n=6)

2.5 樣品測定 取不同批號的四味穿心蓮散，按2.2.2項下方法處理，按上述色譜條件進行測定，計算樣品中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果(μg/g) n=3

3 討論與小結

3.1 波長的優化 在波長選擇上，通過二極管陣列檢測器(PDA)在200～400 nm進行了全掃描，結果顯示穿心蓮內酯在226 nm的波長處有最大吸收，脫水穿心蓮內酯在252 nm的波長處有最大吸收波長，因此本文采用雙波長法，使兩者均有最大吸收。

3.2 提取方式的優化 在提取方式選擇上，比較了浸漬、超聲和回流的提取效果，研究表明浸漬的提取效果略低于超聲與回流，而超聲與回流效果相當，但超聲操作比回流便捷，因此本文采取超聲作為提取方式。

3.3 提取溶劑的優化 在提取溶劑的選擇上，比較了20%甲醇，40%甲醇和60%甲醇的提取效果，研究表明當提取溶劑為20%甲醇時，提取效率顯著低于40%甲醇和60%甲醇；當提取溶劑為60%甲醇時，提取效果與40%甲醇無顯著差異，但雜質干擾嚴重，表明以60%甲醇提取時會將散劑中的一些其他成分提取出來而增加干擾，因此選用40%甲醇作為提取溶劑。

3.4 提取時間的優化 在提取時間的選擇上，比較了15、30、45 min的提取效果，研究表明15min的提取效果顯著低于30、45 min，45 min的提取效果與30 min相當，因此本文選用30 min的提取時間。

本文參考文獻[5-6]選用不同的比例的甲醇-水，甲醇-0.2%磷酸為流動相進行梯度洗脫，結果表明，選用當前試驗的流動相時，樣品中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯分離效果好、無雜峰干擾且時間短。已報道的關于四味穿心蓮散成分含量測定的只有汪艷秋[7]等人開發的HPLC法測定四味穿心蓮散中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量。本文開發的方法所需時間大大縮短，單針時間從45 min減少為20 min，檢測效率大幅提高，更節省溶劑同時減少對環境的污染，尤其適用于大批量檢測，且本文對自制陽性樣品以及多個廠家樣品進行了測定，通過數據的比較反映出不同廠家樣品的區別。

當前，我國中獸藥散劑多數采取顯微鑒別及薄層鑒別控制處方中各味藥材，未對中藥成分進行定量測定。中藥材由于產地、氣候等因素的影響，差異往往很大，如本文中七批企業樣品，含量差異很大，究其原因，很可能是因為藥材產地、氣候等因素的影響，但也不能排除個別企業不按照處方進行制備。因此探索對中獸藥散劑中各味中藥的有效成分進行的定量分析研究，有利于提高中獸藥散劑質量標準的控制，進一步提高產品質量。本文開發的方法，操作簡便快捷，方法可行可靠，可為制定四味穿心蓮散質量標準提供參考。

[1] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典二○一○年版二部[S].[2] Jiun-Han C,George H, An-Rong L,etal.Andrographolide suppresses endothelial cell apoptosis via activation of phosphatidyl inositol-3-kinase/Akt pathway [J]. Biochemical pharmacology, 2004,67(7): 1337-1345.

[3] Yi-Feng X,Bu-Qing Y, Yi-Dan L,etal. Andrographolide attenuates inflammation by inhibition of NF-kappa B activation through covalent modification of reduced cysteine 62 of p50 [J]. Journal of immunology, 2004,173(6): 4207-4217.

[4] 中國獸藥典委員會. 中華人民共和國獸藥典獸藥使用指南二○一○年版中藥卷[S].

[5] 反任睿 , 張園園. 反向高效液相色譜法測定喉舒寧片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量[J]. 中南藥學, 2011, 9(4): 271-273.

[6] 馬冬云 , 姜文艷. 雙波長 HPLC 法同時測定止痢寧片中穿心蓮內酯和脫水穿心蓮內酯的含量[J]. 中國藥師, 2012, 15(4): 497-499.

[7] 汪艷秋, 樓步青, 汪芳, 等. 獸用中成藥四味穿心蓮散質量標準提高研究[J]，中國獸醫醫藥雜志, 2013, 6: 37-40.

(編輯：侯向輝)

Determination of Andrographolide and Dehydroandrographolide in Siwei Chuanxinlian San by Dual-wavelength RP-HPLC

BAQ Ai-qing1, LU Chun-bo1, LIN Xian-jun1, CHEN Xiao-lin1，CAI Wen-jin1，JIN Xiang-lian2

(1.ZhejiangProvinceInstituteofVeterinaryDrugandFeedstuff,Hangzhou311101，China;2.ShangyaoKailunPharmaceuticalCoLtd，Hangzhou31000，China)

To establish a RP- HPLC method for determination of andrographolide and ehydroandrographolide in Siwei Chuanxinlian San，analysis was performed on a C18 column ( 250 mm × 4.6 mm，5 μm) with a gradient elution mode of methanol-0.2% phosphoric acid at a flow rate of 1.0 mL/min and a column temperature of 30 ℃. The determination wave length of andrographolide was 226 nm while dehydroandrographolide was 252 nm. The linear range was 2.32～37.14 μg /mL(r=1.0000) and 2.00～31.94μg /mL (r=1.0000), and the average recovery was 99.12% and 98.84% withRSDof 0.60% and 0.62%, respectively.This method was convenient, accurate and reliable for the determination of andrographolide anddehydroandrographolide in Siwei Chuanxinlian San.

Siwei Chuanxinlian San; HPLC; andrographolide; dehydroandrographolide

包愛情，碩士，從事獸藥檢測工作。E-mail：baoaiqing@126.com

2016-04-07

A

1002-1280 (2016) 06-0056-05

S859.2