不同動物高免血清對豬肺炎支原體的代謝抑制作用研究

孫亞波，魏晶晶，劉富東，王芳，寧宜寶，孫曄,，王鳳霞，沈青春,*

(1.北京中海生物科技有限公司，北京 100081；2.中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

不同動物高免血清對豬肺炎支原體的代謝抑制作用研究

孫亞波1，魏晶晶1，劉富東1，王芳2，寧宜寶2，孫曄1,2，王鳳霞1，沈青春1,2*

(1.北京中海生物科技有限公司，北京 100081；2.中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

選用豬、兔、雞、小鼠和豚鼠5種試驗動物分別制備豬肺炎支原體高免陽性血清，并測定了其對豬肺炎支原體的代謝抑制效價。再從兔高免血清中純化特異性抗體，比較抗體純化前后的代謝抑制效價是否發生變化。結果表明，5種試驗動物高免血清對豬肺炎支原體的代謝抑制價分別為0、104、103、105、102，純化后的抗體仍可抑制豬肺炎支原體的生長，代謝抑制價沒有明顯變化。由此可見，不同動物來源的高免血清對豬肺炎支原體的代謝抑制價不同，代謝抑制作用的主要作用物質為特異性抗體；首次證明病原靶動物——豬的高免抗血清對豬肺炎支原體沒有代謝抑制作用，其他支原體是否也表現為對靶動物(或人)抗血清的耐受性還有待進一步研究。

豬肺炎支原體；代謝抑制作用；高免血清

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae,Mhp)是引起豬地方流行性肺炎(Swine enzootic pneumoniae,SEP)的病原，國內稱為“豬喘氣病”。該病廣泛流行于世界各地，是嚴重危害全球養豬業健康發展的慢性疾病之一[1]。

支原體具有類似于病毒中和作用的代謝抑制(Metabolic inhibition, MI)特性，是細菌所不具有的特殊性質[2]。該特性具有很強的種屬特異性，即抗一種支原體的高免血清只能抑制該種支原體的生長繁殖，而對其他種類的支原體不具有抑制作用，因而以該特性為基礎的代謝抑制試驗和生長抑制試驗已成為支原體鑒定的金標準[3-5]。本實驗室研究工作中發現，豬抗Mhp的高免血清對Mhp似乎不具有代謝抑制作用，而兔抗Mhp的高免血清則抑制作用較強，有關不同動物的抗血清對支原體的代謝抑制作用的相關問題，在國內外還沒有任何報道，甚至代謝抑制相關研究也僅有早期的少量報道。為了調查幾種常見試驗動物抗Mhp高免血清的代謝抑制作用情況，本實驗選用了5種試驗動物進行了免疫和代謝抑制效價測定及相關研究。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌毒種 豬肺炎支原體232株，來自中國獸醫藥品監察所。

1.1.2 試劑和培養基 PPLO、豬血清、馬血清等，購自GIBCO公司；Lps-5支原體液體培養基(含PPLO、葡萄糖、MEM等)和豬肺炎支原體間接血凝(IHA)抗原(批號：201501)，北京中海生物科技有限公司自制。IMS 1313水性佐劑，法國賽比克公司提供。

1.1.3 試驗動物 BalB/C小鼠、豚鼠和清潔級健康家兔，來自北京維通利華實驗動物技術有限公司。SPF雞購自梅里亞。30～40日齡健康仔豬，購自保定某商品代豬場，豬肺炎支原體抗原、抗體陰性，豬瘟、豬偽狂犬、豬藍耳病抗原陰性。

1.2 抗原的制備 開啟豬肺炎支原體232株凍干菌種，使用Lps-5支原體液體培養基，按1/10的接種比例擴大繁殖至5000 mL菌液，8000 r/min離心30 min后，使用PBS(pH 7.2±0.1)100 mL重懸，滅活后1313水性佐劑100 mL，低剪切力混合5～10 min，按照現行《中國獸藥典》附錄要求進行無菌檢驗后，置2～8 ℃避光保存備用。

1.3 陽性血清的制備與檢測 BalB/C小鼠、豚鼠、家兔、SPF雞和仔豬5種動物的數量分別為10只、5只、3只、3只和2頭，單次免疫劑量分別為0.2 mL/只、0.5 mL/只、1 mL/只、1 mL/只和2 mL/頭，首次免疫14日后，每隔一周使用相同劑量加強免疫一次，5次免疫后10日采血分離血清，進行瓊擴效價和IHA效價測定。

1.4 活菌滴度測定 取新鮮培養的豬肺炎支原體232株培養物，按照CCU50測定方法進行活菌濃度測定[6]，用于代謝抑制試驗的培養物CCU50滴度應不低于10-8.0/mL，置-70 ℃以下凍存不超過3個月。

2.活躍課堂氣氛，改變陳舊的教學理念和模式，培養學生自覺思維能力。特別在課堂上要形成師生之間、生生之間的彼此交流、互相質疑，讓學生的創新意識、創新思維能夠互相影響、互相激勵，產生鏈式反應。

1.5 代謝抑制試驗 使用Lps-5支原體液體培養基對經CCU50測定的Mhp 232株培養物進行10倍比稀釋至10-8，在10-6、10-7、10-8三個稀釋度各取1 mL，向其中分別加入1 mL含10%待測抗Mhp陽性血清的液體培養基，充分混勻，取10-6、10-7、10-8三個稀釋度各2 mL作為對照管。另設2 mL液體培養基作空白對照組，于37℃培養14日后判定結果。空白對照不變色，對照組3個滴度都變黃，試驗組至少10-7、10-8兩個滴度不變色即可判定為豬肺炎支原體可被待測陽性血清所抑制。

1.6 代謝抑制效價測定 采用1.5的方法將Mhp 232株培養物10倍比稀釋至10-8，取10-1～10-8七個稀釋度各取1 mL，向其中分別加入1 mL含10%待測抗Mhp陽性血清的液體培養基，充分混勻，取10-6、10-7、10-8三個稀釋度各2 mL作為對照。另設2 mL液體培養基作空白對照組，于37 ℃培養14 d后判定結果。空白對照不變色，3支對照管都變黃，記錄試驗組最后一支變色小管的滴度，并計算出待測陽性血清的代謝抑制價，如10-1～10-3小管變色，10-4～10-7小管不變色，而測定菌液的CCU為108/mL，則共抑制了5個滴度，即待測陽性血清的代謝抑制價為105。

1.7 代謝抑制作用的機理初步研究

1.7.1 豬高免陽性血清中加入兔陰性血清后的代謝抑制價測定 將兔陰性血清與豬抗Mhp陽性血清按1∶1混合，再按照1.5項的方法進行代謝抑制試驗，以確定兔血清中是否存在某種特殊因子有助于抗體對Mhp的代謝抑制作用。

1.7.2 純化兔特異性抗體的代謝抑制效價測定 家兔高免血清表現出較強的代謝抑制作用，為了確定代謝抑制作用是由特異性抗體的結合引起，還是與其他因子共同作用的結果，本試驗將20 mL家兔高免血清經硫酸銨沉淀后用PBS復溶，經分子篩過柱后，獲得純化抗體10 mL(濃度10.4 mg/mL)。將原倍和倍比稀釋物分別替代高免血清按1.6項方法進行代謝抑制效價測定。

2 結 果

2.1 抗原制備 用于抗原制備的豬肺炎支原體232株培養物共計5000 mL，取10 mL分裝成1 mL/支小管，共10支，置-70 ℃以下凍存，用于代謝抑制試驗。其余培養物用于制備抗原，共獲得抗原195 mL，無菌檢驗結果均符合規定。培養物的CCU50測定結果為1.72 × 108CCU50/mL。

2.2 陽性血清的制備與檢測結果 對制備的5種動物的Mhp高免陽性血清進行瓊擴效價測定，同時按照現行《中國獸藥典》進行豬支原體肺炎間接血凝試驗，結果表明5種高免血清的效價均高于1∶10，即均為豬肺炎支原體陽性，其IHA效價和瓊擴效價見表1。

表1 5種動物的高免陽性血清制備結果

2.3 代謝抑制試驗 代謝抑制試驗結果表明BalB/C小鼠、豚鼠、家兔和SPF雞的高免陽性血清都可以不同程度地抑制豬肺炎支原體的生長，而仔豬高免血清的代謝抑制結果為三個稀釋度為均不變色，表現為不抑制，結果見表2。

表2 5種動物的高免陽性血清代謝抑制試驗結果

2.4 代謝抑制價的測定 為進一步確定上述各動物高免血清的代謝抑制能力，對其分別進行代謝抑制價測定，結果見表3。

結果表明，小鼠的高免血清具有很強的代謝抑制特性，代謝抑制價最高，達到105，其次是家兔，可達104，IHA抗體效價最高的豚鼠陽性血清的代謝抑制價則比較低，而IHA抗體效價次高的仔豬的代謝抑制價結果為0，即無抑制。

表3 5種動物的高免陽性血清代謝抑制價測定結果

上述結果表明，不同動物的高免陽性血清對Mhp的代謝抑制能力不同，瓊擴效價和IHA效價均不能很好地反映血清的代謝抑制能力，而本動物——豬高免血清沒有表現出代謝抑制能力。出現上述結果是否與支原體的免疫逃避機制[7-8]有關需要進一步的研究。

2.5 代謝抑制作用的機理初步研究

2.5.1 混合血清的代謝抑制效價測定 家兔高免血清表現出較強的代謝抑制作用，而豬的高免血清盡管瓊擴效價和IHA效價均高，但代謝抑制價測定結果為0，是否說明代謝抑制作用不僅僅與抗體有關，還與存在于兔血清中的其他因子參與其中，本實驗將豬陽性血清等比例混合兔陰性血清后進行代謝抑制價測定，結果見表4。

表4 豬、兔混合血清的代謝抑制價測定結果

結果表明，兔陰性血清并沒有改變仔豬高免陽性血清的代謝抑制效價，由此可見兔陰性血清中不含與代謝抑制有關的成分。2.6 純化的兔特異性抗體的代謝抑制效價測定 本試驗共獲得純化抗體10 mL(濃度10.4 mg/mL)。將原倍和倍比稀釋物的純化家兔特異性抗體分別替代高免血清按1.6項方法進行代謝抑制效價測定，結果見表5。

表5 兔純化抗體的代謝抑制價測定結果

結果表明，兔抗豬肺炎支原體抗體可獨立抑制豬肺炎支原體的生長，抑制作用的強弱與抗體濃度直接相關，抗體濃度降低一半后，代謝抑制作用下降了2個滴度，由此可見二者似乎不呈線性關系。

3 討論與結論

支原體是自然中能獨立生長繁殖的最小生物，其結構簡單，無細胞壁。其代謝抑制特性是在人類發現病毒的抗體中和作用之后發現的，美國科學家1958年首次發現用柯賽基病毒B組抗體可抑制該病毒的感染，即病毒中和作用[9]。1966年，Purcell R H等首次發現兔抗支原體高免血清對相應支原體具有顯著抑制其生長繁殖的作用[2,10]。

本研究需要對不同動物高免血清對支原體的代謝抑制作用的強弱進行評價，首次引入了“代謝抑制效價”的概念及其測定方法，而此前國內外還沒有任何支原體抗血清的代謝抑制強弱及其評價方法的報道，實驗證明“代謝抑制效價”能很好地評價各血清樣品的代謝抑制作用強弱，而且測定方法較為簡單。一直以來國內外用于代謝抑制試驗所用的抗血清多采用兔高免血清，而這可能與家兔容易飼養，并能得到足夠量的血清有關，本研究結果表明在所制備的豬肺炎支原體的高免血清中，鼠高免血清相比兔具有更高的代謝抑制效價，但相比家兔，小鼠血清制備較為困難，單只所得血清量少。

病毒的中和試驗基本原理是特異性抗體主要通過封閉病毒與細胞的結合受體使其失去感染性[11]。支原體的代謝抑制特性是否與病毒的中和特性相似？本研究采用了純化后的兔源特異性抗體進行試驗，發現其可以抑制豬肺炎支原體的生長，但為何豬的高免血清對Mhp又不具有代謝抑制作用？是因為不同動物抗體在種屬特異性結構上的差異，還是其他原因造成這樣的結果，還需要進一步的實驗研究予以解答。

Mhp對其靶動物——豬的抗Mhp高免血清幾乎沒有代謝抑制作用的結論，就引出了一個新問題，豬支原體肺炎當前最主要的防治手段是免疫預防，即接種弱毒活疫苗和滅活疫苗，弱毒活疫苗能產生細胞免疫和體液免疫，獲得很好的免疫保護力容易理解，而滅活疫苗則主要產生體液免疫，即產生針對Mhp的抗體。病毒疫苗的體液免疫主要通過中和作用實現抗感染，而從本文結論可知豬支原體肺炎疫苗似乎不太可能是通過特異性抗體的代謝抑制作用實現抗感染。Mhp滅活疫苗是當前全球用于預防豬支原體肺炎最主要的工具之一，事實證明可以使豬體產生良好的免疫保護力[12-13]，其產生抗感染的作用的產生可能與代謝抑制沒有直接關系，而與細菌疫苗的抗感染作用相似。

豬陽性血清對Mhp不具有代謝抑制作用，將對Mhp的培養具有很好的應用參考價值，一些文獻要求配制用于培養豬肺炎支原體的培養基所使用的豬血清為Mhp抗體陰性[14]，而Mhp抗體陰性的成年豬極難找到，得到大量陰性血清非常困難[15]。本研究的結果顯示試驗Mhp抗體陽性的豬血清對Mhp不具有代謝抑制作用，因而不影響Mhp的生長繁殖，即用于Mhp培養的豬血清無需要求Mhp抗體陰性。

本研究首次報到了Mhp的靶動物——豬的抗Mhp高免血清對Mhp不具有代謝抑制作用，兔抗Mhp特異性抗體可獨立抑制Mhp的生長。其他支原體是否也對靶動物(或人)的高免抗血清具有耐受性，該特性是否與代謝抑制作用的機理有關，還有待進一步的研究。

[1] 沈青春, 寧宜寶, 覃青松, 豬肺炎支原體的研究進展[J]. 中國獸藥雜志,2003, 37(6):26-30.

[2] Purcell R H, Wong D, Chanock R M,etal, Significance of antibody to mycoplasma as measured by metabolic-inhibition techniques[J]. Ann N Y Acad Sci,1967,143:664-675.

[3] Poveda J B, Nicholas R. Serological identification of mycoplasmas by growth and metabolic inhibition tests[J]. Methods Mol Biol,1998,104:105-111.

[4] Poveda J B. Biochemical characteristics in mycoplasma identification[J]. Methods Mol Biol,1998,104:69-78.

[5] Assuncao P, Diaz R, Comas J,etal. Evaluation ofMycoplasmahyopneumoniaegrowth by flow cytometry[J]. J Appl Microbiol,2005,98:1047-1054.

[6] 沈青春, 李聰研, 馮倩倩, 等.用半數變色單位法精確測定支原體活菌滴度[J]. 微生物學報,2013, 53(12):1347-1352.

[7] Bogema D R, Deutscher A T, Woolley L K,etal. Characterization of cleavage events in the multifunctional cilium adhesin Mhp684 (P146) reveals a mechanism by whichMycoplasmahyopneumoniaeregulates surface topography[J]. mBio,2012, 3(2):1-11.

[8] Deutscher A T, Jenkins C, Minion F C,etal. Repeat regions R1 and R2 in the P97 paralogue Mhp271 ofMycoplasmahyopneumoniaebind heparin, fibronectin and porcine cilia[J]. Mol Microbiol,2010,78:444-458.

[9] Rogers N G, Bankhead A S, Crawford I P,etal. Metabolic inhibition test for determination of antibodies to group B Coxsackie viruses[J]. Proc Soc Exp Biol Med,1958,98:227-231.

[10]Purcell R H, Taylor-Robinson D, Wong D C,etal. A color test for the measurement of antibody to the non-acid-forming humanMycoplasmaspecies[J]. Am J Epidemiol,1966,84:51-66.

[11]Tebruegge M, Curtis N. Enterovirus infections in neonates[J]. Semin Fetal Neonatal Med,2009,14:222-227.

[12]Wilson S, Van Brussel L, Saunders G,etal. Vaccination of piglets at 1 week of age with an inactivatedMycoplasmahyopneumoniaevaccine reduces lung lesions and improves average daily gain in body weight[J]. Vaccine,2012, 30(52):7625-7629.

[13]Simionatto S, Marchioro S B, Maes D,etal.Mycoplasmahyopneumoniae: from disease to vaccine development[J]. Vet Microbiol,2013,165:234-242.

[14]Marois C, Le Carrou J, Kobisch M,etal. Isolation ofMycoplasmahyopneumoniaefrom different sampling sites in experimentally infected and contact SPF piglets[J]. Vet Microbiol,2007,120:96-104.

[15]Xiong Q, Wei Y, Feng Z,etal. Protective efficacy of a live attenuatedMycoplasmahyopneumoniaevaccine with an ISCOM-matrix adjuvant in pigs[J]. Vet J,2014,199:268-274.

(編輯：李文平)

Metabolic Inhibition Studies on Different Animal Hyperimmune Antiserum againstMycoplasmahyopneumoniae

SUN Ya-bo1,WEI Jing-jing1,LIU Fu-dong1,WANG Fang2,NING Yi-bao2,SUN Ye1,2,WANG Feng-xia1, SHEN Qing-chun1,2*

(1.BeijingZhonghaiBiotechCo.Ltd.,Beijing100081,China; 2.ChinaInstituteofVeterinaryDrugControl,Beijing100081,China)

Five kinds of experimental animals, including pig, rabbit, chicken, mice and guinea pig were immuned repeatedly to prepare hyperimmune serum againstMycoplasmahyopneumoniae(Mhp), and the metabolic inhibition potency of the sera were determined. The purified specific antibody from rabbit hyperimmune sera was used for the potency determination,too.The results showed that the metabolic inhibitory potency to Mhp of the hyperimmune sera from five kinds of animals were 0,104,103,105and 102, respectively.The purified specific antibody could inhibit the growth of Mhp, and the potency was 104. Therefore, the metabolic inhibitory potency against Mhp of the hyperimmune serum from different animals was different. The main effective material of metabolic inhibition was the specific antibody. The agent target animal —— pig’s hyperimmune antiserum against Mhp could not inhibit the growth of Mhp. Whether or not the other mycoplasma has the tolerance to antiserum from target animals (or human) needs to be further studied.

Mycoplasmahyopneumoniae; metabolic inhibition; hyperimmune antiserum

孫亞波，本科，從事獸用生物制品的研制工作。

2016-09-27

A

1002-1280 (2016) 12-0007-05

S858.28