恩諾沙星與乙酰甲喹聯用體外抗菌活性研究

蔣公建，駱世軍，雷元軍，范建彪，符華林，魏世軍

(1.重慶市萬州區畜牧站，重慶萬州 404100；2.重慶先鋒動物藥業有限公司，重慶萬州 404100；3.四川農業大學動物醫學院獸藥創新制劑工程技術研究中心，成都 611130；4.重慶市開州區畜牧獸醫局，重慶開州 405400)

恩諾沙星與乙酰甲喹聯用體外抗菌活性研究

蔣公建1,2，駱世軍2，雷元軍2，范建彪2，符華林3*，魏世軍4

(1.重慶市萬州區畜牧站，重慶萬州 404100；2.重慶先鋒動物藥業有限公司，重慶萬州 404100；3.四川農業大學動物醫學院獸藥創新制劑工程技術研究中心，成都 611130；4.重慶市開州區畜牧獸醫局，重慶開州 405400)

為考察恩諾沙星與乙酰甲喹的聯合抗菌活性，采用肉湯稀釋棋盤法測定了恩諾沙星與乙酰甲喹單用及聯用對大腸桿菌、沙門氏菌臨床菌株的體外抗菌活性。結果顯示：恩諾沙星與乙酰甲喹單獨使用對大腸桿菌的最小抑菌濃度為8 μg/mL和32 μg/mL，對沙門氏菌的最小抑菌濃度為16 μg/mL和256 μg/mL。兩藥聯用對大腸桿菌和沙門氏菌的FIC指數為0.5和0.75，分別表現為協同作用和相加作用。試驗表明，恩諾沙星與乙酰甲喹聯用可以增強對大腸桿菌和沙門氏菌感染的治療效果。

乙酰甲喹；恩諾沙星；聯合抗菌；FIC指數

恩諾沙星是第一個動物專用的氟喹諾酮類抗菌藥物，1987年由德國拜耳公司投放市場，我國于1993年研制成功。恩諾沙星具有殺菌活性強、抗菌譜廣、生物利用度高、毒副作用小等優點，近年已廣泛用于獸醫臨床，對于防治動物大腸桿菌、巴氏桿菌、嗜血桿菌、霉形體感染等疾病有良好效果[1-3]。乙酰甲喹是我國首創的治療豬痢疾的首選和特效藥，具有用量小、見效快、療效高等優點，其抗菌機理可能與抑制菌體DNA合成有關。除主治豬痢疾外，乙酰甲喹也是治療禽霍亂、仔豬黃痢和白痢、犢牛傷寒等疾病及多種畜禽消化道感染的主要藥物[4-5]。

隨著養殖業規模化、集約化發展，抗菌藥物的大量使用、不合理應用和濫用造成臨床產生了大量的耐藥菌株，給臨床感染性疾病的防治造成一定的困難。因此，尋求新的聯合用藥技術是目前獸醫臨床研究的熱點。恩諾沙星和乙酰甲喹均是對消化道感染性疾病具有較好療效的抗菌藥物，但由于廣泛使用，近年來耐藥菌株也不斷出現。為了提高臨床抗菌效果，近年來有人將恩諾沙星和乙酰甲喹聯合用于臨床，王傲雪報道了乙酰甲喹與諾氟沙星、恩諾沙星等藥聯用抗雞源沙門氏菌，但并未表現協同作用[7]。目前養豬業中將恩諾沙星與乙酰甲喹聯用治療大腸桿菌和沙門氏菌感染也較多，但未見二者對豬場臨床菌株聯合藥敏試驗的報道。本研究采用兩倍稀釋法和棋盤法測定乙酰甲喹和恩諾沙星單用及聯用對豬源大腸桿菌和沙門氏菌臨床株的體外抑菌活性，以期篩選出能明顯增強對大腸桿菌和沙門氏菌抗菌活性的復方制劑，為臨床乙酰甲喹與恩諾沙星合理配伍提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 乙酰甲喹，含量99%，山西兆益生物有限公司，批號20130314；恩諾沙星，含量99.5%，浙江國邦藥業有限公司，批號20120321。M-H液體培養基、M-H瓊脂購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗菌株 大腸桿菌、沙門氏菌，四川農業大學藥物安全性評價研究室提供，系臨床分離致病菌,2014年6月分離于四川樂山某豬場。質控菌為大腸桿菌ATCC25922，購自中國獸醫藥品監察所。

1.3 方法

1.3.1 菌液制備 將大腸桿菌和沙門氏菌分別接種于10 mL營養肉湯中，37 ℃培養6 h后10倍等比稀釋不同倍數后接種M-H瓊脂平板，37 ℃培養16～18 h后菌落計數，選擇菌落數在100～300的平板，計算菌懸液的濃度，將菌懸液稀釋至106CFU/mL待用。

1.3.2 藥液的配制 精密稱取乙酰甲喹和恩諾沙星，無菌操作配制成1024 μg/mL的藥液，置4 ℃冰箱保存備用，各貯存液在一周內用完。

1.3.3 單藥最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 取經滅菌過的96孔微型反應板4塊，采用兩倍稀釋法分別測定乙酰甲喹和恩諾沙星對大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度。將乙酰甲喹與恩諾沙星各自稀釋到濃度為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μg/mL后分別加入96孔板每排的第1～11孔，第12孔作為陽性對照，各孔分別加入100 μL稀釋菌液。每藥做4組稀釋，其中第四組為陰性對照。將微孔板置于37 ℃恒溫箱內培養24 h后觀察，結果取平均值，求得兩藥的MIC。從開始有細菌生長的前一孔開始向前每孔用接種環接種試驗液于瓊脂平板上，于37 ℃下培養24 h后觀察，求得MBC。

其中，FIC≤0.5 為協同作用；0.52為拮抗作用。

2 結果與分析

2.1 乙酰甲喹與恩諾沙星單用對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC值 結果見表1。可以看出，乙酰甲喹和恩諾沙星對大腸桿菌的抑菌效果均優于對沙門氏菌的抑菌效果，而對同種菌株而言，恩諾沙星的抑制效果均優于乙酰甲喹。

表1 乙酰甲喹、恩諾沙星對大腸桿菌和 沙門氏菌的MIC值 μg/mL

將各藥MIC值的前三孔(包括最小抑菌濃度孔)的培養液接種于瓊脂平板上于37℃下培養24 h后觀察，測定各藥的MBC值，結果見表2。恩諾沙星和乙酰甲喹對兩種菌的殺菌濃度與抑菌濃度相隔很近，所以臨床上二者多用作殺菌藥。

表2 乙酰甲喹、恩諾沙星對大腸桿菌和 沙門氏菌的MBC值 μg/mL

兩種藥物單獨用藥的結果顯示，在對大腸桿菌和沙門氏菌的體外抑菌試驗中，不論是MIC還是MBC，恩諾沙星均低于乙酰甲喹，在治療有大腸桿菌和沙門氏菌引起的疾病時恩諾沙星可能比乙酰甲喹有更好的療效。

2.2 聯合藥敏試驗結果

2.2.1 兩藥聯用對大腸桿菌的藥敏試驗結果 乙酰甲喹、恩諾沙星聯合用藥對大腸桿菌的MIC值見表2。可以看出，當乙酰甲喹與恩諾沙星聯合運用時，乙酰甲喹和恩諾沙星對大腸桿菌的MIC分別為8 μg/mL和2 μg/mL，均小于單獨藥敏試驗時的MIC。將所得MIC值代入FIC指數計算公式，求得兩藥聯用對大腸桿菌的FIC指數為0.5，表現為協同作用。

表2 恩諾沙星與乙酰甲喹對大腸桿菌的聯合藥敏試驗結果

“+”表示有細菌生長；“-”表示無細菌生長

2.2.2 兩藥聯用對沙門氏菌的藥敏試驗結果 乙酰甲喹、恩諾沙星聯合用藥對沙門氏菌的MIC值測定結果見表3。可以看出，當乙酰甲喹與恩諾沙星聯合運用時，乙酰甲喹和恩諾沙星對沙門氏菌的MIC分別為64 μg/mL和8 μg/mL，均小于單獨藥敏試驗時的結果。將所得MIC值代入FIC指數計算公式，求得兩藥聯用對沙門氏菌的FIC指數為0.75，表現為相加作用。

表3 恩諾沙星與乙酰甲喹對沙門氏菌的聯合藥敏試驗結果

“+”表示有細菌生長；“-”表示無細菌生長

3 討 論

腸道感染是獸醫臨床中常見的疾病，可由病毒和細菌感染引起，其中大腸桿菌和沙門氏菌是引起腸道感染的主要病原，目前針對大腸桿菌和沙門氏菌引起的腸道感染主要采取抗菌藥物來進行治療。但是，獸醫臨床在使用抗菌藥物時常常針對性不強，濫用藥物現象比較嚴重，由此帶來的賴藥性使抗菌藥物的效果越來越差。同時，我國腸道感染疾病多呈混合感染或者繼發感染，單一抗感染藥物往往無法控制多種病原體混合感染的局面，因此，聯合用藥已成為克服單一抗感染藥物抗菌范圍有限而不能有效防治混合感染的缺陷的一種較好方案。

恩諾沙星與乙酰甲喹是獸醫臨床常用的治療腸道感染的抗菌藥物。恩諾沙星抗菌譜廣，殺菌活性強，能有效殺死靜止期和生長期的細菌，對多種革蘭氏陰性桿菌如大腸桿菌、沙門氏菌以及球菌都能起到良好的抗菌效果[8-9]。但是由于使用廣泛其耐藥性報道日益增多，特別沙門氏菌的耐藥性比較明顯[2,10-11]。乙酰甲喹對革蘭陰性菌作用更強，廣泛用于治療雞或豬的腸道細菌性疾病[5]。近年來為了增強抗菌效果及降低毒性，常將乙酰甲喹與其他藥物聯合使用。

本實驗采用體外聯合藥敏的方法考察了恩諾沙星與乙酰甲喹聯合運用對大腸桿菌和沙門氏菌的MIC的變化。兩藥單獨使用時恩諾沙星和乙酰甲喹對大腸桿菌和沙門氏菌的抗菌活性都較強，但恩諾沙星的抗菌效果明顯優于乙酰甲喹，是乙酰甲喹的4～16倍；兩藥對大腸桿菌的效果也優于其對沙門氏菌的效果，這與部分文獻報道的結果比較一致[2]，只是恩諾沙星與乙酰甲喹對兩株菌的MIC值跟文獻報道稍有差異，這可能跟細菌的血清型或者區域用藥習慣有關[4,12-13]。恩諾沙星與乙酰甲喹聯用對大腸桿菌和沙門氏菌臨床株的FIC指數分別為0.5和0.75，說明恩諾沙星和乙酰甲喹對兩種菌的抗菌作用呈協同或者相加效應。對大腸桿菌聯合應用時恩諾沙星和乙酰甲喹的MIC均為其單獨使用時MIC的1/4，說明臨床中兩藥聯合用于治療由大腸桿菌引起的疾病時，在保證治療效果的前提下，可降低恩諾沙星和乙酰甲喹的用量，降低用藥成本，提高經濟效益。同樣，在對沙門氏菌聯合應用時恩諾沙星的MIC為其單獨使用的1/2，乙酰甲喹為其單獨用藥的1/4，說明臨床中兩藥也可以聯合用于治療由沙門氏菌引起的疾病。

乙酰甲喹和恩諾沙星都是獸醫臨床治療中常用的廣譜抗菌藥物，其良好的治療效果得到廣大獸醫工作者的好評。恩諾沙星與乙酰甲喹呈協同作用，臨床聯合用藥時可以大大減少藥物用量，從而有效防止耐藥菌的產生。同時，隨著藥物用量的減少，也可減少藥物在肉食品、土壤和水中的殘留，從而減輕給人畜健康造成傷害。

[1] 苑麗, 潘玉善, 班曼曼,等.頭孢噻呋與恩諾沙星聯用體外抗菌活性研究[J].河南畜牧獸醫(綜合版), 2007，28(12): 5-6.

[2] 張浩, 王英俊, 馬豐英,等. 恩諾沙星對禽類主要致病菌的體外抑菌實驗[J]. 中國畜牧獸醫文摘，2014，30(9): 209-210.

[3] Persson Y, Katholm J, Landin H.Efficacy of enrofloxacin for the treatment of acute clinical mastitis caused byEscherichiacoliin dairy cows[J].Vet Rec, 2015, 176(26): 673.

[4] 農超群, 李毅竦, 周振新,等.乙酰甲喹與TMP聯用對雞白痢沙門氏菌的藥敏試驗和實驗性治療效果觀察[J].中國獸藥雜志, 2000, 34(5): 57-60.

[5] 楊志坤, 崔笑博, 解相霞,等.乙酰甲喹與6種抗菌藥對雞大腸埃希菌的體外聯合藥敏試驗研究[J].國外醫藥(抗生素分冊), 2014，35(5): 213-215.

[6] 吳俊偉, 楊俊卿.恩諾沙星與硫酸粘菌素聯合抗菌活性的研究[J].西南農業大學學報(自然科學版), 2006，28(4): 558-561.

[7] 王傲雪，張凌云，張桉潮，等.肉雞沙門氏菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國畜牧獸醫,2013,40(7): 167-171.

[8] Knoll U, Glunder G, Kietzmann M.Comparative study of the plasma pharmacokinetics and tissue concentrations of danofloxacin and enrofloxacin in broiler chickens[J].J Vet Pharmacol Ther, 1999, 22(4): 239-246.

[9] Cengiz M, Sahinturk P, Sonal S,etal.Invitrobactericidal activity of enrofloxacin against gyrA mutant and qnr-containingEscherichiacoliisolates from animals[J].Vet Rec, 2013, 172(18): 474.

[10]潘華芳.豬沙門菌對恩諾沙星耐藥判定標準研究[D].華中農業大學,2012.

[11]李乾學, 王大成, 吳永魁,等.雞沙門菌恩諾沙星耐藥性風險評估[J].中國獸醫學報, 2013, 33(2): 254-258.

[12]張子佳, 王宏偉, 孫勇.慶大霉素、環丙沙星、恩諾沙星對大腸桿菌的體外抑菌試驗[J].現代畜牧獸醫, 2009,(9): 51-52.

[13]德育慧, 樊明春, 王楓.復方恩諾沙星可溶性粉對畜禽主要致病菌的體外抑菌效果[J].動物醫學進展, 2009, 30(7): 46-49.

(編輯：李文平)

Study on the Antibacterial Activity of Enrofloxacin Combined with Mequindoxinvitro

JIANG Gong-jian1,2,LUO Shi-jun2,LEI Yuan-jun2,FAN Jian-biao2, FU Hua-lin3*,WEI Shi-jun4

(1.AnimalHusbandryBureauofWanzhouDistrict,Wanzhou,Chongqing404100,China;2.PioneersAnimalsPharmaceuticalCo.Ltd.ofChongqing,Wanzhou,Chongqing404100,China;3.InnovativeEngineeringResearchCenterofVeterinaryPharmaceutics,CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu625014,China；4.AnimalHusbandryandVeterinaryBureauofKaizhouDistrict,Kaizhou,Chongqing405400,China)

In order to study on the combined antibacterial activity of enrofloxacin and mequindox,Broth microdilution checkerboard method was used to detect theinvitroantibacterial activity of enrofloxacin alone and combined with mequindox againstEscherichiacoliandSalmonellaisolates.Results showed that MIC of enrofloxacin and mequindox againstEscherichiacoliwas 8 μg/mL and 32 μg/mL when they were used alone,and MIC of them againstSalmonellawas 16 μg/mL and 256 μg/mL.When enrofloxacin and mequindox were combined,the FIC againstEscherichiacoliandSalmonellaisolates was 0.5 and 0.75 respectively,which indicated the synergic action onEscherichiacoliand additive effect onSalmonella.The results suggest that the combined use of enrofloxacin and mequindox can enhance the treatment effect ofEscherichiacoliandSalmonellainfections.

mequindox; enrofloxacin; combined antibacterial activity; FIC index

蔣公建，高級獸醫師，從事獸藥研發與推廣工作。

2016-07-30

A

1002-1280 (2016) 12-0019-05

S859.79