固相萃取/UPLC-MS/MS法檢測飼料中18種喹諾酮類藥物的研究

彭玉芬，蔡杰，蔡勤仁，薛良辰，黃晶，凌蕓輝

( 珠海出入境檢驗檢疫局技術中心，廣東珠海519015)

固相萃取/UPLC-MS/MS法檢測飼料中18種喹諾酮類藥物的研究

彭玉芬，蔡杰，蔡勤仁，薛良辰，黃晶，凌蕓輝

( 珠海出入境檢驗檢疫局技術中心，廣東珠海519015)

為了建立超高效液相色譜-串聯質譜法測定飼料中18種喹諾酮類藥物的分析方法，以0.1%乙酸乙腈提取飼料樣品中的待測物，HLB柱凈化，超高效液相色譜-串聯質譜法測定，氘代同位素內標法定量。18種喹諾酮類藥物在線性范圍為0～1.0 mg/L，線性關系良好，相關系數分別在0.9989～0.9999之間，方法的檢測限為0.005～0.2 mg/kg。在不同飼料中添加濃度范圍為0.1～5.0 mg/kg，平均回收率為43.0%～101%，相對標準偏差小于11.2%。結果表明，該方法靈敏、高效、抗干擾力強，適用于飼料中的18種喹諾酮類藥物的測定。

超高效液相-串聯質譜法；固相萃取；飼料；喹諾酮類藥物

喹諾酮類(quinolones)為人工合成的抗菌藥，是一類人畜通用的藥物。因其具有抗菌譜廣、抗菌活性強、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性和毒副作用小等特點，被廣泛應用于畜牧、水產等養殖業中，包括在雞、鴨、鵝、豬、牛、羊、魚、蝦、蟹等的養殖中用于疾病防治。飼料是動物的直接食品，它的安全與否直接關系到動物食品的安全，飼料的不安全因素會通過食物鏈對人類的安全健康造成危害。若長期食用被此類藥物污染的食品，可能會誘導人類病原微生物產生耐藥性和抗藥性，嚴重時，會對食用者產生消化系統及中樞神經系統等不良反應[1]。歐盟、世界衛生組織及我國都對動物源性食品中喹諾酮類藥物制定了最大殘留限量，農業部也對飼料中喹諾酮類藥物的使用作了相關規定[2]。因此，建立一種同時檢測飼料中多種喹諾酮類藥物的方法具有重要意義。

目前，飼料中喹諾酮類藥物的檢測方法不能覆蓋常用的喹諾酮類藥物，不利于養殖中全面監控，文獻報道關于飼料中喹諾酮藥物含量檢測方法較少，主要有高效液相色譜法[3-4]、毛細管電泳法[5]和液質聯用法[6-7]。飼料中18種喹諾酮類藥物檢測采用高效液相色譜法基質干擾大；毛細管電泳法難以普及。所以本研究采用超高效液相色譜-串聯質譜法進行分析檢測，該方法靈敏、高效、重現性好、雜質干擾小，滿足飼料中喹諾酮藥物檢測的準確定性和定量的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯API4000Q Trap 質譜儀(美國ABI公司)；Hitachi CR22GH離心機(日本日立公司)；ZymarkTurboVap@LV氮氣濃縮儀(美國Caliper公司)；KQ-500DE型超聲波清洗儀(昆山市超聲波儀器有限公司)；負壓固相萃取裝置(美國Agilent公司)；HS250B 型搖床(德國IKA 集團)；MS3 basic 渦旋混合器(德國IKA 集團)；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)。

1.1.2 藥品與試劑 恩諾沙星、環丙沙星、沙拉沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、單諾沙星、麻保沙星、惡喹酸、氟甲喹、萘啶酸、司帕沙星、奧比沙星、氟羅沙星、依諾沙星、吡哌酸均、鹽酸恩諾沙星-D5、鹽酸環丙沙星-D8、諾氟沙星-D5和惡喹酸-D5(德國Dr.Ehrenstorfer公司)，純度大于95%；甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純(美國Merck公司)；乙酸銨(色譜純，美國Fisher Chemical公司)；氨水(分析純，廣州化學試劑廠)；Waters Oasis HLB固相萃取柱(3 mL /60 mg)，使用前依次用3 mL甲醇，3 mL水活化。

標準物質儲備液：分別稱取18種喹諾酮類標準品適量，以甲醇溶解并定容至25 mL，4 ℃冰箱中避光保存。

混合標準工作液(10.0 mg/L)：分別取18種喹諾酮類藥物儲備液適量于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，4 ℃冰箱中避光保存。

4種喹諾酮類內標物質儲備液：分別準確稱取鹽酸恩諾沙星-D5、鹽酸環丙沙星-D8、諾氟沙星-D5和惡喹酸-D5標準品適量，以色譜純甲醇溶解并定容至25 mL，4 ℃冰箱中避光保存。

內標混合標準工作液(10.0 mg/L)：分別取4種喹諾酮類內標物質儲備液適量于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，4 ℃冰箱中避光保存。

5.0 mmol/L乙酸銨溶液(含0.1%的甲酸)：溶解0.385 g乙酸銨于1000 mL水中，再加入1.0 mL的甲酸，4 ℃冰箱中保存。

1.2 樣品前處理方法 稱取2 g(精確到0.01 g)樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 μL內標混合標準工作液，4 mL水浸泡1 h，加入20 mL 1 %乙酸乙腈，振蕩15 min，超聲波震蕩提取10 min，4000 r/min離心5 min，上清液倒出至另一離心管，用乙腈定容至25 mL，取5 mL 50 ℃氮氣濃縮至0.5 mL，加水至10 mL，混合均勻，備用。

移取上述樣品液至Oasis HLB固相萃取柱凈化，控制流速以不超過1.0 mL /min的速度通過固相萃取小柱，用6 mL水和6 mL 20 % 甲醇淋洗，抽干。6 mL 5%氨水-甲醇洗脫，收集洗脫液，50 ℃氮氣濃縮至近干，加入2 mL 5 mmol /L 乙酸銨(含0.1% 的甲酸)-乙腈(90+10，V/V)溶解殘渣，渦旋混勻，過0.22 μm微孔濾膜，用于LC-MS/MS檢測。

1.3 儀器條件

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱：UPLC ACQUITY BEH C18柱(2.1 mm× 100 mm，1.7 μm)；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL；流動相A 為5 mmol /L 乙酸銨(含0.1% 的甲酸)，B 為乙腈，梯度洗脫(表1)。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質譜條件 離子源: 電噴霧離子源( ESI)；正離子掃描；多反應監測(MRM)模式；噴霧電壓：5500 V；霧化氣：60 psi，氣簾氣：25 psi，輔助加熱氣：65 psi；碰撞氣：Medium，四種氣體均為氮氣；離子源溫度：550℃；碰撞能量、去簇電壓、定性離子對及定量離子對等見表2。

表2 18種喹諾酮類藥物的質譜分析優化參數

*代表定量離子

2 結 果

2.1 基質標準曲線及檢測限 將混合標準工作液依次稀釋得到標準系列，內標濃度0.05 mg/L，由低到高的濃度進行測定，以標準溶液濃度(X)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標繪制標準曲線。由于樣品基質溶液對18種喹諾酮類藥物的靈敏度有不同程度的影響，試驗用空白基質溶液稀釋標準系列，消除基質效應。其中，線性范圍為0～0.2 mg/L的標準系列是0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 mg/L，0～1.0 mg/L的標準系列是0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L。檢測限依據信噪比S/N>3確定。回歸方程和檢測限見表3-表5，從表中可以看出，在建立的色譜質譜條件下，18種喹諾酮類藥物在各自的線性范圍內呈現良好線的線性關系。

表3 18種喹諾酮類藥物在全價配合飼料中的線性回歸方程、相關系數和檢測限

表4 18種喹諾酮類藥物在濃縮飼料中的線性回歸方程、相關系數和檢測限

表5 18種喹諾酮類藥物在預混飼料中的線性回歸方程、相關系數和檢測限

2.2 回收率及精密度 在空白配合飼料、濃縮飼料和預混飼料中添加18種喹諾酮類藥物混合標準工作液和內標混合標準工作液，配合飼料0.1、0.5、1.0 mg/kg，濃縮飼料和預混飼料0.1、0.5、1.0、5.0 mg/kg，內標濃度為0.5 mg/kg，每個濃度6個重復，同時做空白對照，按1.2處理方法進行處理后上機測試(圖1)。回收率和精密度見表6，從表6中可以看出，18種喹諾酮類藥物平均回收率在43.0%～101%之間，相對標準偏差4.0%～11.2%之間，說明該法在不同飼料中準確度和精密度好，穩定可靠。

表6 18種喹諾酮類藥物在飼料中回收率及相對標準偏差(n=6)

續表

續表

圖1 配合飼料添加18種喹諾酮類藥物0.1 mg/kgTIC圖

3 討論與小結

3.1 提取溶劑的選擇 飼料是由能量飼料(谷物等)、蛋白質飼料(魚粉、骨肉粉等)、礦物質飼料(貝殼粉、食鹽等)以及各種添加劑(微量元素、維生素等)經過加工混合而成。飼料按營養成分分為配合飼料、濃縮飼料和添加劑預混合飼料等，飼料基質復雜且干燥，喹諾酮藥物在飼料中不易解離，直接用有機溶劑提取會造成很大的損失，回收率也受到影響，所以先用兩倍的水浸泡。喹諾酮類藥物屬于酸堿兩性化合物，在多數溶劑中溶解性差，在pH≤4或pH≥9時，喹諾酮類藥物易溶于含水相，pH 6～8時易于有機溶劑反萃取，絕大多數樣品使用酸化或堿化溶劑作為提取溶劑[8]，試驗比較了乙腈-2%氫氧化氨溶液、1%乙酸-乙腈溶液、1%三氯乙酸-甲醇溶液和N,N-二甲基甲酰胺-0.1 mol/L鹽酸溶液提取效率，發現1%乙酸乙腈作為提取溶劑回收率較高且雜質干擾最小，故本實驗選用1%乙酸乙腈溶液作為提取溶劑。3.2 凈化條件的確定 飼料基質復雜，濃縮后直接檢測干擾大且污染儀器。參考了GB/T 23412-2009[9]、GB/T 21312-2007[10]、SN/T 3649-2013[11]和文獻[12-13]的凈化方法，比較正己烷、Waters OasisMCX陽離子交換固相萃取小柱、PAX陰離子交換固相萃取小柱以及Oasis HLB固相萃取小柱凈化效果，結果發現用Oasis HLB固相萃取小柱凈化，20%甲醇水淋洗，6 mL 5%氨水-甲醇洗脫，18種喹諾酮類藥物回收率最理想。

3.3 質譜條件和色譜條件的選擇 結果表明，喹諾酮類化合物的二級質譜中主要的碎片離子峰是喹諾酮藥物分子的脫水峰[M+H-18]+、脫羧峰[M+H-44]+以及脫羧后哌嗪環斷裂發生結構重排失去C2H4NR2的產物離子[M+H-CO2-C2H4NR2]+。較低豐度的離子峰有[M+H-64]+、[M+H-CO2-C2H4NR2-14]+，[M+H-64]+應是氟喹諾酮脫羧后再丟失HF分子產生的帶電離子，[M+H-CO2-C2H4NR2-14]+是氟喹諾酮脫羧后哌嗪環斷裂發生結構重排失去C3H6NR2的產物離子。依據食品法典委員會和歐盟第657/2002/EEC號中有關規定[13]，選擇最強的兩對離子對作為定量和定性離子對。

流動相的組成和配比會影響待測物的色譜行為及其靈敏度，試驗選擇含0.1% 的甲酸的5 mmol/L乙酸銨與乙腈作為流動相，能較好的分離18種待測物和消除拖尾現象。

研究采用同位素內標液質聯用技術測定飼料中18種喹諾酮類藥物，方法操作簡單、快速、回收率和精密度好，覆蓋了常用的喹諾酮類藥物，應用該方法，對33份飼料中的喹諾酮類藥物進行了檢測，7份飼料中檢出恩諾沙星殘留，含量在0.2 ～ 1.4 mg/kg之間，為飼料中喹諾酮類藥物溯源和衛生監督提供了技術依據。

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[14]European Union(2002/657/EEC), Official Journal of the European Union[Z], L221/8-9, 2002, EN.

(編輯：陳希)

Determination of 18 Quinolones in Feeds with Solid Phase Extraction by UPLC-MS/MS

PENG Yu-fen, CAI Jie, CAI Qin-ren, XUE Liang-chen, HUANG Jing, LING Yun-hui

(ZhuhaiInspection&QuarantineBureauTechnologyCenter,Zhuhai,Guangdong519015,China)

An ultra high performance liquid chromatography - tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) mehtod was developed to determine 18 quinolones in feeds. 18 quinolones were extracted by 0.1% acetic acid-acetonitrile solution , cleaned up with SPE of HLB column and detected by UPLC-MS/MS. Quantitative results were based by isotope internal standard method. The calibration curve of 18 quinolones showed good linearity in the range of 0～1.0 mg/L with conrrelation coefficient of 0.9989 and 0.9998 respectively. The detection limits of method were 0.005～0.2 mg /kg. The average recoveries of 18 quinolones at the spiked levels of 0.1～5.0 mg/kg in feeds ranged from 43.0%～101% with relative standard deviation less than 11.2%. Experiments showed that the method was sensitive, high efficiency and good anti-interference. The method adapted to the detection of 18 quinolones in feeds.

UPLC-MS/MS; solid phase extraction; feeds; quinolones

珠海出入境檢驗檢疫局科技計劃項目( ZH 2014-3)

2016-08-05

A

1002-1280 (2016) 12-0051-08

S859.79