戴世鯤，何 慧，李 濤，吳華蓮，向文洲，曾海心

（中國科學院南海海洋研究所/中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣東 廣州 510301）

螺旋藻基因組中糖苷酶類基因的序列分析

戴世鯤，何 慧，李 濤，吳華蓮，向文洲，曾海心

（中國科學院南海海洋研究所/中國科學院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點實驗室，廣東 廣州 510301）

在NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中可檢索到3個鈍頂螺旋藻藻株、1個極大螺旋藻藻株、1個鹽澤螺旋藻藻株和1個螺旋藻屬未定種的藻株基因組序列。6個螺旋藻基因組序列來源的糖苷酶基因共計32個，編碼蛋白含260～1 084個氨基酸，BLAST序列比對顯示，與非螺旋藻種屬來源的已知序列的相似性在49%～84%之間。系統(tǒng)進化分析表明，32個糖苷酶基因聚類成8個簇，另有3個基因分別單獨構成進化分支。酶學功能預測顯示，這些糖苷酶基因分別屬于8個糖苷酶家族（GH3、GH9、GH13、GH23、GH25、GH38、GH57、GH104），具有8種糖苷酶催化活性（纖維素酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、α-淀粉酶、普魯蘭酶、1，4-α-葡聚糖分支酶、肽聚糖結合功能、β-葡萄糖苷酶）。

螺旋藻；基因組；糖苷酶

螺旋藻（Spirulina）是一種多細胞絲狀微藻，是微藻產(chǎn)業(yè)的重要藻種，具有極高的開發(fā)價值。螺旋藻屬于藍藻門（Cyanophyta）、段殖藻目（Hormogonales）、顫藻科（Oscillatoriaceae）、螺旋藻屬（Spirulina）。螺旋藻現(xiàn)已改名為節(jié)旋藻（Arthrospira），但由于螺旋藻這一名稱一直被廣泛使用，因而這兩種名稱被同時使用。目前，用于工業(yè)化生產(chǎn)的螺旋藻主要有鈍頂螺旋藻（S.platensis）和極大螺旋藻（S.maxima）［1］。

研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻含有60%～71%的蛋白質以及其他豐富而獨特的生物活性物質，如γ-亞麻酸、藻藍蛋白、β-胡蘿卜素、肌醇、螺旋藻多糖、維生素B12和大量礦質元素等，是一種國際公認的超級營養(yǎng)食品［1］。

多糖一般由10個以上的單糖聚合成，單糖以醛糖或酮糖的形式通過糖苷鍵線性或分枝連接，分為同多糖和雜多糖。螺旋藻多糖是一類重要的天然生物活性物質，是從螺旋藻藻體中提取分離出來的水溶性生物大分子，螺旋藻多糖占藻體2%～3%，具有免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗輻射、抗衰老、抗病毒等多種生物學功能，是目前國內外海洋藥物研究的熱點之一［2］。螺旋藻多糖屬于酸性雜多糖，組成結構復雜。一般認為，一部分多糖與蛋白質結合形成糖蛋白，多糖鏈有支鏈結構，單糖之間多數(shù)以α-糖苷鍵相連，也有發(fā)現(xiàn)存在β-糖苷鍵，其多糖鏈由巖藻糖、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖以及葡萄糖醛酸等分子組成［3-5］。

目前對螺旋藻多糖的研究包括其生物學活性評價、多糖的提取工藝和多糖的結構組成等，但是對于螺旋藻多糖的生物學代謝過程及其相關酶類的酶學機制缺乏研究。

糖苷酶是多糖生物學代謝過程中的重要組成酶類。糖苷酶（Glycosidase）又稱為糖基水解酶（Glycoside hydrolase），具有催化糖苷鍵水解的活性，不需要任何輔酶或輔助因子，在國際酶學命名中歸位序號為EC3.2.1，根據(jù)氨基酸序列的進化關系，分為133個家族［6］。

本研究對NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中的6個不同螺旋藻基因組中的糖苷酶基因序列進行生物信息學檢索和分析，為進一步對這些糖苷酶酶學性質及其螺旋藻多糖的生物代謝過程和基因工程研究提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在NCBI（http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/）基因組數(shù)據(jù)庫中可檢索到6個不同的螺旋藻基因組序列，分別是Arthrospira platensis NIES-39、Arthrospira platensis C1、Arthrospira platensis str.Paraca、Arthrospira maxima CS-328、Arthrospira sp.PCC 8005、Spirulina subsalsa PCC 9445。根據(jù)這些基因組序列的基因注釋信息可檢索到27個序列不同的糖苷酶基因，在NCBI數(shù)據(jù)庫中的編號分別是WP_006621369、WP_006670090、Y P_0 0 5 0 6 8 5 7 3、W P_0 3 5 7 3 6 8 5 5、W P_0 0 6 6 1 6 9 3 8、W P_0 0 8 0 5 7 1 2 6、W P_0 0 6 6 2 1 4 7 0、W P_0 0 6 6 1 7 8 6 1、W P_0 0 6 6 2 5 7 8 4、W P_0 0 6 6 6 9 1 4 0、W P_0 3 3 3 7 4 2 5 8、W P_0 3 3 3 7 5 4 2 5、W P_0 0 6 6 2 5 8 1 0、W P_0 0 8 0 5 2 4 4 2、W P_0 0 6 6 1 9 7 7 5、W P_0 1 7 3 0 5 6 3 2、W P_0 0 6 6 1 7 7 2 8、W P_0 0 6 6 2 2 8 3 9、WP_006668919、YP_005069303、YP_005071301、EKD07789.1、YP_005066672、WP_014274076、YP_005068490、EKD10749.1、WP_008057264。

1.2 試驗方法

在NCBI網(wǎng)站中使用Protein BLAST工具在GenBank的NR數(shù)據(jù)庫中對27個糖苷酶氨基酸序列進行同源性比對，驗證基因注釋信息的正確性。并將這些氨基酸序列提交到糖苷酶類研究的相關網(wǎng)站dbCAN（http://csbl.bmb.uga.edu/dbCAN/annotate.php）和CAZymes Analysis Toolkit（http://cricket.ornl.gov/cgi-bin/cat.cgi）中，進行檢索和比對，推測糖苷酶的家族和酶學功能［7-8］。使用Clustal X軟件對糖苷酶基因的氨基酸序列進行多序列比對。由MEGA軟件根據(jù)鄰位相連法（NeighborJointing method，NJ）構建系統(tǒng)進化樹，用Bootstrap進行檢驗，重復次數(shù)為1 000次，分析其可靠性［9］。

2 結果與分析

2.1 螺旋藻基因組序列概況

目前在NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中可檢索到3個鈍頂螺旋藻藻株（Arthrospira platensis NIES-39、Arthrospira platensis C1、Arthrospira platensis str.Paraca）、1個極大螺旋藻藻株（Arthrospira maxima CS-328）和另外2個螺旋藻種屬（Arthrospira sp.PCC 8005、Spirulina subsalsa PCC 9445鹽澤螺旋藻）的基因組序列（表1）。典型的螺旋藻基因組大小為5.0～6.7 Mb，平均GC含量為44.3%～44.8%，基因組中被注釋的基因數(shù)有4 515～6 094個［10-13］。2個鈍頂螺旋藻藻株A.platensis NIES-39和A.platensis C1已經(jīng)得到整個基因組圖譜。

表1 NCBI數(shù)據(jù)庫中螺旋藻基因組序列的基本信息

2.2 螺旋藻基因組中糖苷酶基因的多樣性

來源于上述6個螺旋藻基因組序列的糖苷酶基因共計32個，其中來自A.platensis NIES-39有5個，來自A.platensis C1有7個，來自A.platensis str.Paraca有6個，來自A.maxima CS-328有5個，來自Arthrospira sp.PCC 8005有6個，來自Spirulina subsalsa PCC 9445有3個。其中來源于A.platensis C1的3條基因的氨基酸序列與來源于Arthrospira sp.PCC 8005的3條序列兩兩完全一致，分別是WP_006621369、WP_006625784、WP_006622839；A.platensis C1的另外2條基因與來源于A.maxima CS-328的2條序列兩兩完全一致，分別是WP_006621470、WP_006625810。因此，32條糖苷酶基因中具有不同氨基酸序列的有27條。

圖1 6個螺旋藻基因組中糖苷酶基因的系統(tǒng)進化樹

糖苷酶基因系統(tǒng)進化樹（圖1）中代表序列（表2）的比對分析結果表明，這些糖苷酶基因編碼蛋白含260～1 084個氨基酸，與非螺旋藻種屬來源的已知序列的相似性為49%～84%，既具有較高的同源性，也存在很大的差異，其酶學性質均未得到充分闡明。序列比對中同源性最高的非螺旋藻種屬序列均來自藍藻門（表2），分別為Lyngbya（鞘絲藻屬）、Oscillatoria（顫藻屬）、Crinalium（發(fā)毛針藻屬）、Filamentous cyanobacterium（絲狀藍藻）、Tolypothrix（單歧藻屬）、Planktothrix（浮游藍絲藻屬）。

表2 糖苷酶基因系統(tǒng)進化樹中代表序列的比對分析

系統(tǒng)進化分析結果（圖1）表明，32個糖苷酶基因聚類成8個簇，另有Arthrospira platensis NIES-39的1條基因和Spirulina subsalsa PCC9445的2條基因分別單獨構成1個進化分支。同一進化簇中的基因同源性很高，但是8個簇和3個單獨分支之間的同源性很低，同一簇中均為來自不同藻株的基因。進化簇與非螺旋藻種屬來源的已知序列相似性高于70%的只有簇Ⅴ和簇Ⅷ，其他6個簇和3個單獨分支的序列相似性均低于70%。

2.3 螺旋藻基因組中糖苷酶基因的功能預測

選取8個進化簇的代表序列和3個單獨分支序列在GenBank的NR數(shù)據(jù)庫中進行氨基酸序列比對分析，對酶蛋白保守的結構功能域進行分析，并將序列提交至糖苷酶類的分析網(wǎng)站dbCAN和CAZymes Analysis Toolkit，對糖苷酶的酶學功能進行預測，結果（表2）表明，這些糖苷酶基因分別歸屬于GH3、GH9、GH13、GH23、GH25、GH38、GH57、GH104等8個糖苷酶家族，具有的酶催化活性包括纖維素酶、溶菌酶、α-甘露糖苷酶、α-淀粉酶、普魯蘭酶、1，4-α-葡聚糖分支酶、肽聚糖結合功能、β-葡萄糖苷酶。

將屬于GH3家族的簇Ⅶ和Ⅷ的5條序列進行同源性比對分析，在2個簇內部分別具有非常高的同源性，同時2個簇之間在53個氨基酸位點具有保守性（圖2），這與2個簇屬于同一個糖苷酶家族但具有2種不同的酶活性的預測結果一致。而屬于GH57家族的7條序列具有3種不同的糖苷酶活性，序列比對分析顯示，7條序列僅存在18個保守位點，同時S.subsalsa PCC9445來源的2條單獨分支的序列之間同源性很低（圖3）。

圖2 GH3家族糖苷酶基因的氨基酸序列比對

圖3 GH57家族糖苷酶基因的氨基酸序列比對

3 結論與討論

在NCBI基因組數(shù)據(jù)庫中可檢索到6個螺旋藻基因組序列，包含糖苷酶基因32個，其中具有不同氨基酸序列的有27條。系統(tǒng)進化分析顯示，32個糖苷酶基因聚類成8個簇和3個單獨的進化分支。對這些糖苷酶基因的酶學功能進行預測，結果顯示分別屬于8個糖苷酶家族，具有8種糖苷酶催化活性。6個螺旋藻藻株中的4個藻株（A.platensis C1、A.platensis str.Paraca、A.maxima CS-328、Arthrospira sp.PCC 8005）的5個糖苷酶基因共同歸于進化簇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ，顯示這4個藻株的糖苷酶基因具有很高的同源性。而A.platensis NIES-39藻株的5個糖苷酶基因則有明顯差異，分別歸于簇Ⅰ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ和1個單獨的進化分支。Spirulina subsalsa PCC 9445藻株（鹽澤螺旋藻）的3個糖苷酶基因尤為特殊，均屬于GH57家族，其中2條序列為單獨的進化分支，另一條序列在簇Ⅴ中與其他4條序列的進化關系也比較遠。

糖苷酶在生物體的糖和糖綴合物的水解與合成過程中具有重要作用，對其性質和功能的研究一直是生物學和糖生物學研究的熱點。螺旋藻多糖組成結構復雜，由于多糖類物質分離純化困難，以及各種分離檢測方法等存在一定差異，導致可能得出不同的結果，因此僅通過螺旋藻多糖準確的一級結構推測多糖的生物合成過程具有很大難度。利用螺旋藻基因組信息，從多糖合成相關酶類基因的角度，通過對螺旋藻糖苷酶酶學催化機制的闡明，可為螺旋藻多糖生物學合成過程的研究及其基因工程提供有力支撐。

糖苷酶具有很高的應用價值，可用于酶法制備功能性低聚糖。低聚糖又稱寡糖（Oligosaccharide），由2～10個單糖聚合成。功能性低聚糖有利于人體腸道中的雙歧桿菌等有益菌群，調節(jié)腸道微生態(tài)系統(tǒng)，從而促進健康。此外，還具有非致齲齒性和良好的口感等特點，因此被用作功能性食品添加劑［14］。目前，利用糖苷酶水解天然多糖或利用糖苷酶酶法合成是功能性低聚糖生產(chǎn)的重要方式［15］。32條螺旋藻糖苷酶基因中有24條序列與非螺旋藻種屬來源的已知序列的相似性均低于70%，這些酶基因必然具有未知的、不同的酶學性質和催化活性。通過深入研究這些螺旋藻糖苷酶，能夠為螺旋藻產(chǎn)業(yè)多元化發(fā)展提供一定的應用基礎。

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（責任編輯 崔建勛）

Sequence analysis of glycosidase genes in Spirulina （Arthrospira） genome

DAI Shi-kun，HE Hui，LI Tao，WU Hua-lian，XIANG Wen-zhou，ZENG Hai-xin
（South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences/ Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology，Guangzhou 510301，China）

There are genome sequences of three Arthrospira platensis strains，an Arthrospira maxima strain，a Spirulina subsalsa strain，an Arthrospira sp.strain in the NCBI genome database up to date.32 glycosidase genes can be retrieved from the 6 Spirulina genome sequences，which have 260-1 084 amino acids in length.By BLAST analysis in GenBank，the similarity with the known sequences from the non-Spirulina species was 49%-84%.Phylogenetic analysis indicated that the 32 glucosidase genes were divided into 8 groups，and the other 3 genes constituted an independent evolutionary branch，respectively.The enzyme function prediction of these glucosidase genes showed that they belonged to 8 glucosidase families： GH3，GH9，GH13，GH23，GH25，GH38，GH57，GH104，and 8 kinds of glycosidase catalytic activity： cellulase，lysozyme，α-mannosidase，α-amylase，pullulanase，1，4-α-glycogen branching enzyme，peptidoglycan binding function，β-glucosidase.

Spirulina； genome； glycosidase

Q754

A

1004-874X（2016）12-0115-07

10.16768/j.issn.1004-874X.2016.12.020

2016-08-11

海南省科技興海專項（2015XH04）；廣東省海洋漁業(yè)科技與產(chǎn)業(yè)發(fā)展專項（A201501C09）

戴世鯤（1977-），男，博士，助理研究員，E-mail：deepseabio@163.com

戴世鯤，何慧，李濤，等.螺旋藻基因組中糖苷酶類基因的序列分析［J］.廣東農業(yè)科學，2016，43（11）：115-121.