黃連總生物堿對結核菌PhoPR 雙組份系統基因轉錄水平影響的研究

曾范利，于丹，姜園園，時坤，李健明，宗穎，趙丹，杜銳，4*

(1. 吉林農業大學中藥材學院，長春 130118；2. 長春市動物疫病預防控制中心，長春 130061；3. 吉林農業大學農業質量標準與檢測技術研究中心，長春 130118；4. 吉林省梅花鹿生產與產品應用研究室，長春 130118)

黃連總生物堿對結核菌PhoPR 雙組份系統基因轉錄水平影響的研究

曾范利1，于丹2，姜園園1，時坤1，李健明1，宗穎1，趙丹3，杜銳1，4*

(1. 吉林農業大學中藥材學院，長春 130118；2. 長春市動物疫病預防控制中心，長春 130061；3. 吉林農業大學農業質量標準與檢測技術研究中心，長春 130118；4. 吉林省梅花鹿生產與產品應用研究室，長春 130118)

為研究黃連總生物堿對結核菌PhoPR雙組份系統基因轉錄水平的影響，對不同藥物作用的菌液提取總RNA并進行反轉錄，根據GenBank 中H37Rv的PhoP (0757) 基因、PhoR(0758) 基因和SigA的基因序列，應用Primer6.0軟件設計熒光定量引物并進行熒光定量PCR分析。結果顯示：在高濃度黃連生物堿作用時，多藥耐藥結核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表達水平明顯下降，并且黃連總生物堿與RPF聯合作用時，多藥耐藥結核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表達水平明顯下降，表明黃連生物堿是RFP抗菌增效劑。本試驗為結核菌抗菌增效作用機制研究奠定了理論基礎。

黃連總生物堿；結核菌；PhoPR 雙組份系統；轉錄水平

鹿結核病是由結核分枝桿菌引起的鹿的慢性消耗性傳染病，可侵犯全身各器官，但以肺結核為最多見，嚴重威脅著養鹿業的健康發展[1]。病鹿尤其是具有開放性結核的病鹿是人類結核病的主要傳染源之一。由于結核分枝桿菌為長期胞內寄生菌，可以長期處于休眠狀態，沒有有效的疫苗和藥物進行控制，為降低結核病給公共衛生和人類帶來的危害，大部分發達國家采用檢疫和撲殺相結合的方式來消除結核病[2]，但是檢疫和撲殺不是根除動物結核病和人類結核病的長期有效方法。近年來隨著耐藥性結核菌株的增加，多藥耐藥結核病的防治已成為難題[3]。

結核菌PhoPR雙組份系統是對外環境變化作出感知的重要系統，在外界環境變化時，PhoPR雙組份系統會對結核分枝桿菌做出相應的調控，使結核分枝桿菌更容易適應生長環境的變化[4]。有報道表明，PhoPR可能與結核分枝桿菌的致病力、毒性作用、細胞膜的通透性、外排泵、耐藥性和新型疫苗的研制有關[5]。PhoPR雙組分系在結核分枝桿菌的致病作用中扮演著重要的角色，而且是一個潛在的候選目標[6]。因此本試驗以標準人型結核分枝桿菌H37Rv為對照菌株，以鹿源多藥耐藥結核菌為試驗模型菌，選擇PhoPR雙組份系統為研究對象，在國內率先研究本課題組前期篩選出的RFP的抗菌增效劑黃連總生物堿對PhoPR雙組份系統基因表達的影響，初步探討黃連總生物堿作為結核菌抗菌增效劑的作用機制并且為多藥耐藥結核病的防治奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株及試劑 標準人型結核分枝桿菌H37Rv、鹿源耐藥性牛型結核分枝桿菌(MB-1)和耐藥性人型結核分枝桿菌(MT-7)由吉林大學于錄教授惠贈；黃連總生物堿為實驗室提取保存；利福平(rifampicin, RFP) 購于中國藥品生物制品檢定所；小檗堿(Berberine)購于成都普菲德生物技術有限公司；Middlebrook7H9肉湯和Middlebrook-OADC增菌液購于BD Difco 公司；β-巰基乙醇購于Sigma公司；DEPC和緩沖溶液(TE butter)購于維特杰生物技術有限公司；細菌RNA提取試劑盒(RNApure Bacteria Kit，CW0536)和溶解酶(Lysozyme，CW0887)購于康為世紀公司， SYBR?Premix EX TaqTMⅡ和PrimescriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase購于大連TaKaRa公司。

1.2 菌液及藥物菌液的制備 標準菌H37Rv、鹿源耐藥性結核分枝桿菌MB-1、MT-7以無菌7H9培養基培養5～10 d后，將菌液移至含有直徑為1 mm玻璃珠的10 mL的離心管中，于漩渦震蕩儀上震蕩、打碎，取上層菌液加入與麥氏比濁管同樣大小的試管中，以無菌7H9肉湯培養基稀釋成1號麥氏比濁管濃度，并無菌稀釋20倍制備成20 mL的菌液。

黃連總生物堿單用：分別向H37Rv、MB-1、MT-7的20 mL菌液加入黃連總生物堿，使黃連總生物堿的終濃度為0、1/4、1/2、1 MIC(μg/mL)。加入之后37 ℃，無菌培養5～10 d，至肉眼可見菌膜生成及對數生長期。

黃連總生物堿與RFP聯用：分別向H37Rv、MB-1、MT-7的20 mL菌液加入黃連總生物堿和利福平，終濃度為黃連總生物堿(單獨)：1/4MIC(μg/mL)，RFP(單獨)：1/4MIC(μg/mL)，黃連總生物堿1/4MIC(μg/mL)+ RFP 1/4MIC(μg/mL)及無藥空白培養基。加入之后37 ℃，無菌培養5～10 d，至肉眼可見菌膜生成及對數生長期。

1.3 結核分枝桿菌總RNA的提取及反轉錄 將培養好的菌液移至2 mL的離心管中，4 ℃，10000 r/min離心4 min收集菌體，清洗菌液2次，然后小心除凈上清液，將菌體移至處理好的預凍研缽中，倒入液氮，快速研磨至白粉末狀，重復2次，然后按照細菌RNA提取試劑盒RNApure Bacteria Kit-CW0536說明書操作，獲得結核分枝桿菌總RNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量并用超微量快速核酸測定儀檢測總RNA含量。采用PrimescriptTMRT reagent Kit With gDNA Erase反轉錄試劑盒進行去除基因組DNA和反轉錄兩步反應。按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 PhoPR雙組份系統的PhoP、PhoR基因和SigA內參基因的引物設計及熒光定量PCR 根據GenBank中H37Rv的PhoP(0757)基因、PhoR(0758)基因和SigA的基因序列，應用Primer6.0軟件設計熒光定量引物如(表1)并由大連寶生物公司合成。通過梯度PCR摸索，PhoP、PhoR和SigA的基因引物的最適宜退火溫度分別為62 ℃、62 ℃、60 ℃。反應的條件為95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60～62 ℃退火/延伸30 s，總共進行40個循環，根據熒光信號獲得擴增曲線；反應后進行溶解曲線的反應，反應條件為95 ℃ 15 s，60 ℃持續15 s，從60 ℃增至95 ℃保持20 min。

表1 熒光定量PCR引物

1.5 數據處理及分析 基因表達量分析以內參為對照，采用2-△△Ct分析方法進行數據的統計分析，通過SPSS Statistics 17.0進行差異性檢驗分析。

2 結果

2.1 總RNA的質量與含量的測定結果 H37Rv、MB-1、MT-7的RNA的OD260/OD280比值均在1.9～2.0之間，表明總RNA的含量符合要求。通過RNApure Bacteria Kit試劑盒獲得RNA，電泳之后可見兩條明顯的條帶，分別為16S、23S條帶(圖1)，表明總RNA的質量符合后續試驗的要求。

M：DL 2000；1：0 MIC黃連總生物堿；2：1 MIC黃連總生物堿；3：1/2 MIC黃連總生物堿；4：1/4 MIC黃連總生物堿；5：1/4 MIC 利福平；6：1/4 MIC黃連總生物堿+1/4 MIC 利福平圖1 六個濃度藥物作用結核分枝桿菌的RNA電泳圖

2.2 PhoP、PhoR基因的mRNA相對表達量 耐藥菌株MB-1、MT-7的PhoP的基因表達量分別是H37Rv的16.7倍和7.5倍，P<0.05有統計學意義，耐藥菌株MB-1、MT-7的PhoR的基因表達量分別是H37Rv的4.7倍和8.2倍，差異有統計學意義P<0.05(圖2)。

圖2 H37Rv、MB-1、MT-7的PhoP和PhoR基因表達水平

2.3 黃連總生物堿作用下PhoP、PhoR基因的mRNA相對表達量 隨著黃連濃度的增加，H37Rv的PhoP、PhoR 基因的表達處于上升趨勢，P>0.05無統計學意義；MB-1、MT-7的PhoP、PhoR 基因表達處于上升后下降的趨勢，P<0.05有統計學意義。黃連總生物堿濃度為1/4MIC時MT-7的PhoP、PhoR基因表達原始狀態相比相差不大，MB-1的PhoP、PhoR基因表達是原始狀態的6.9倍和5.4倍；黃連總堿濃度為1/2MIC時MT-7的PhoP、PhoR基因表達比原始狀態下調了0.82倍和0.86倍，MB-1的PhoP、PhoR基因表達量與原始狀態相差不大；黃連總堿濃度為1 MIC時MT-7的PhoP、PhoR基因表達量比黃連總堿濃度為1/4MIC時下調1.3倍和1.2倍，MB-1的PhoP、PhoR基因表達量比黃連總堿濃度為1/4MIC時下調5.4倍和4.1倍(圖3)。

圖3 黃連總生物堿作用下H37Rv、MB-1、MT-7的PhoP、PhoR基因表達水平

2.4 黃連總生物堿與RFP作用下PhoP、PhoR基因的mRNA相對表達量 雖然H37Rv在藥物黃連總生物堿與RFP藥物作用下PhoP、PhoR基因的表達量有所差異，但P>0.05無統計學意義；MB-1、MT-7在藥物黃連總生物堿與RFP作用下PhoP、PhoR基因的表達量有所差異，而且MB-1、MT-7在藥物黃連總生物堿與RFP聯用的作用下，PhoP、PhoR基因的表達量均比在單獨用黃連和單獨用RFP的表達量降低了，差異有統計學意義，P<0.05(圖4)。

圖4 黃連總生物堿和RFP作用下H37Rv 、MB-1、MT-7的PhoP、PhoR 基因表達水平

3 討論

結核分枝桿菌Pho PR雙組分系統是結核分枝桿菌編碼的11個完整的雙組分系統中最基本、最重要的調節系統。它可以感應外界環境變化，并做出相應反應的調控，能夠使結核分枝桿菌更好的適應宿主微環境變化，以及協助結核分枝桿菌逃避宿主的免疫監視和殺滅，促使其在宿主體內生存、繁殖、致病等。同時對結核分枝桿菌在宿主體內的生長、分化、代謝、滲透調節、繁殖、毒性、趨化性、變異性、致病性等方面發揮著重要的調控作用[7-8]。對于PhoRP雙組份系統在耐藥菌中的調控作用是否伴有相關耐藥基因的高表達以及與細菌中的其他調控系統共同發揮作用，其與耐藥性之間的關系尚不清楚，還需要進一步研究。

中藥是我國歷史悠久的自然資源，在治療疾病方面顯示了獨特的療效。研究表明中藥中存在潛在的對抗細菌耐藥的增敏劑或逆轉劑。目前研究抗結核的中藥有黃芩、夏枯草、苦參，大蒜素等，而黃連抗結菌研究的較少。黃連的主治功效為清熱解毒，消炎止痛，還有抑菌、抗炎的作用，同時提高機體的免疫力，主要成分為小檗堿(黃連素)，以小檗堿研究居多。匡鐵吉等[9]發現黃連素(小檗堿)對H37Rv在濃度為100 μg/mL有殺菌作用，60 μg/mL有抑菌作用。目前，對于黃連總生物堿的研究較少，且集中于黃連總生物堿的降血糖、胃粘膜損傷的保護作用等，而對結核菌的作用未見報道。因此，本試驗在前期試驗的基礎上，以黃連總生物堿及與RFP聯合作用于標準菌和鹿源多藥耐藥結核菌，研究黃連總生物堿對結核菌PhoPR雙組份系統基因轉錄水平的影響。

本研究的結果表明，在無藥狀態下，在耐藥菌MB-1、MT-7中PhoP、PhoR基因的表達明顯高于在H37Rv的，這可能是由于耐藥菌MB-1、MT-7的培養環境發生了改變，PhoPR雙組分系統能感知外界環境變化作出反應，使PhoP、PhoR表達提高；在高濃度黃連生物堿作用時，多藥耐藥結核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表達水平明顯下降，說明黃連總生物堿可能降低了MB-1、MT-7的耐藥性；并且黃連總生物堿與RPF聯合作用時，多藥耐藥結核菌MT-7、MB-1的PhoP和PhoR的基因的表達水平明顯下降，說明黃連總生物堿與RFP能協同抑制結核菌[10]，表明黃連生物堿是RFP抗菌增效劑，其作用機制有待進一步深入研究，從而為解決動物源結核分枝桿菌的耐藥性問題做出有益的探索。

[1] 杜銳. 中國養鹿與疾病防治[M]. 吉林: 中國農業出版社，2010: 404.

[2] Zanella G, Bar-Hen A, Boschiroli M L,etal．Modelling transmission of bovine tuberculosis in Red Deer and Wild Boar in Normandy, France[J]. Zoonoses and Public Health, 2012, 59(2):170-178.

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[9] 匡鐵吉，董梅，宋萍，等. 黃連素對結核分枝桿菌的體外抑菌作用[J]. 中國中藥雜志，2001，35(12)：71-72.

[10]姜園園，曾范利，杜銳, 等. 抑制鹿源多藥耐藥結核菌中藥的篩選[J]. 動物醫學進展，2016，37(4)：54-57.

(編輯：李文平)

Study on the Effect of Transcriptional Level on PhoPR Two-component System Genes byCoptischinensisTotal Alkaloids

ZENG Fan-li1, YU Dan2, JIANG Yuan-yuan1, SHI Kun1,LI Jian-ming1, ZONG Ying1, ZHAO Dan3, DU Rui1,4*

(1.CollegeofChineseMedicineMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China;2.ChangchunPreventionandControlCenterofAnimalDisease,Changchun130061,China;3.ResearchCenterofAgricultureQualityStandardandDetectingTechnique,JilinAgricultureUniversity,Changchun130118,China;4.LaboratoryofProductionandProductApplicationofSikaDeerofJinlinProvince,Changchun130118,China)

To study the effect of transcriptional level on PhoPR two-component system genes byCoptischinensistotal alkaloids, the different concentrations ofCoptischinensistotal alkaloid or in combination with RFP were applied to detect sensitivity to MT-7, MB-1 and H37Rv. Then the total RNA was extracted and reverse transcribed. The expression level of PhoP and PhoR genes belonging to the PhoPR two-component system which was related to drug resistance were analyzed and compared by realtime fluorescence quantitative PCR. The results showed that the expression level of PhoP and phoR of MT-7, MB-1 was decreased significantly with the high concentration of total alkaloids fromCoptidisrhizoma. The expression of level of PhoP and phoR of MT-7 and MB-1 was decreased significantly byCoptischinensistotal alkaloid combined with RFP. The results showed thatCoptischinensistotal alkaloid was antibacterial synerists of RFP. The result will provide a theoretical basis for mechanism of action of antibacterial synerists.

Coptischinensistotal alkaloids; tuberculosis bacteria; PhoPR two-component system; trans-criptional level

吉林省科技廳重點科技攻關項目(20150204028NY)；吉林省科技廳科技成果轉化促進計劃(20140309018YY)

曾范利，講師，博士，從事經濟動物疫病與病原學研究。

杜銳。E-mail：durui71@126.com

2016-08-08

A

1002-1280 (2016) 09-0006-05

S852.61