重組犬瘟熱病毒F-H融合基因乳酸菌的構建及表達

蘇鳳艷，李哲，李艷芝，王春鳳，曾范利

(1.吉林農業大學中藥材學院 吉林 長春 130118；2.吉林省伊通滿族自治縣畜牧工作總站 吉林 伊通 130700；3.吉林省動物微生態制劑工程研究中心 吉林 長春 130118)

重組犬瘟熱病毒F-H融合基因乳酸菌的構建及表達

蘇鳳艷1，李哲1，李艷芝2，王春鳳3，曾范利1

(1.吉林農業大學中藥材學院 吉林 長春 130118；2.吉林省伊通滿族自治縣畜牧工作總站 吉林 伊通 130700；3.吉林省動物微生態制劑工程研究中心 吉林 長春 130118)

為了構建重組犬瘟熱病毒(CDV)F-H融合基因工程乳酸菌，采用重疊延伸PCR(SOE-PCR)技術擴增CDV F-H融合基因。將F-H融合基因亞克隆至穿梭載體pSIP409多克隆位點上，構建pSIP-F-H表達重組子，并電轉化至植物乳桿菌NC8感受態細胞中。利用SDS-PAGE和Western blotting檢測F-H融合蛋白的表達情況。結果表明，成功地擴增了CDV F-H融合基因，構建了pSIP-F-H重組表達質粒，并電轉化至乳酸桿菌感受態細胞中。SDS-PAGE和Western blotting檢測表明，重組乳酸桿菌表達了分子量約為62.96 ku的F-H融合蛋白，且該蛋白能與CDV陽性抗體反應，具有反應原性。

犬瘟熱病毒；F-H融合基因；乳酸桿菌；表達

犬瘟熱系由副粘病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒(Canine distemper virus, CDV)引起的高度接觸性傳染病[1]。自1809年發現CD以來,該病已給經濟動物養殖業、養犬業、野生動物保護業、動物園觀賞業造成了巨大的損失[2]。且隨著CDV的變異、動物對流行病因素的適應，CDV易感宿主的范圍有擴大的趨勢，流行趨勢由散在發生趨勢向群發趨勢發展，臨床癥狀也越來越復雜，其危害也越來越大，單純依靠傳統疫苗免疫不能徹底防制犬瘟熱的流行與發生[3]，有必要研制新型的基因工程疫苗來防控疾病的暴發。

CDV由基質蛋白(M)、核衣殼蛋白(NP)、磷蛋白(P)、血凝蛋白(H)、融合蛋白(F)和大蛋白(L)6種結構蛋白組成[4]，其中H和F兩種糖蛋白組成病毒囊膜表面纖突，CDV通過H蛋白吸附到細胞表面的受體上，起細胞趨向作用，而F蛋白介導病毒與感染細胞、感染細胞與非感染細胞間融合，使病毒具有在宿主體內擴散的能力，是感染性病毒粒子進入宿主細胞所必需的，且可能介導病毒感染[5]。具有中和作用的抗H蛋白抗體和抑制細胞融合的抗F蛋白抗體，在抗CDV感染的機制中發揮重要作用，是機體的主要保護性抗原，是目前制備CDV亞單位疫苗或合成疫苗的首選抗原[6-7]。因此，本研究以穿梭載體pSIP409為工具，構建可表達CDV F-H基因的重組基因工程乳酸菌，為進一步研究基因重組乳酸桿菌的免疫效果及免疫保護作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株和載體 大腸桿菌乳酸菌穿梭質粒載體pSIP409和植物乳桿菌NC8由印度卡馬拉杰大學Anbazhagan.K高級研究員惠贈，吉林農業大學王春鳳教授保存。菌株E.coliBL21和DH 5α由吉林農業大學經濟動物實驗室保存。pMD-18T-CDVF和pMD-18T-CDVH重組克隆質粒由本研究室構建。

1.2 工具酶和主要試劑 DNA Marker、EcoRⅠ、HandⅢ、T4 DNA連接酶、PCR試劑盒均為TaKaRa公司產品； DNA凝膠回收試劑盒為杭州維特潔生化技術有限公司產品；蛋白質分子量標準為上海生物化學研究所產品。兔抗犬瘟熱陽性血清由中國農科院左家特產研究所惠贈；HRP標記的山羊抗兔IgG為北京鼎國生物技術有限公司產品。PVDF轉移膜為Gleman公司產品。

1.3 引物的設計與合成 為了擴增CDV的F -H融合基因,共設計了2對4條引物。根據犬瘟熱病毒F和H基因設計特異性引物P1和P2、P3和P4。引物 P1引入EcoRI 酶切位點，引物 P2引入一段由高親水性氨基酸(Gly-Pro-Gly-Pro-Gly )編碼基因GCCCGGACCCGGACC組成的linker；引物 P3引入與P2互補的linker，引物P4引入Hind Ⅲ酶切位點。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

F-Linker上游引物P1: ATTAGAATTCCTTAGGTATTATACTGAGT

F-Linker下游引物P2：GCCCGGACCCGGACCAGAGCGCCTAACCGTCTGAA

Linker-H上游引物P3: GGTCCGGGTCCGGGCACACCTATGGATCATGTTGAG

Linker-H下游引物P4：CATTAAGCTTTTAACGGTTACATGAGA

1.4 犬瘟熱病毒H基因、F基因和F-H融合基因的擴增與純化 分別以克隆質粒pMD18T-CDVF和pMD18T-CDVH質粒為模板，PCR擴增用于構建乳酸菌表達載體的F和H基因片段。

F-Linker反應體系：模板1μL ，上游引物0.5 μL，下游引物0.5μL，2×Master Mix 12.5μL，ddH2O 10.5μL，總體系25 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃熱變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min。

Linker-H反應體系：模板1 μL ，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，2×Master Mix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，總體系25 μL。反應條件：94 ℃預變性4 min，94 ℃熱變性30 s，58.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環，最后72 ℃延伸10 min。

F-H融合基因PCR反應體系：F-Linker回收產物0.4 μL，Linker-H回收產物0.6 μL，F-Linker上游引物P1 0.5 μL，Linker-H下游引物P4 0.5 μL，2×Master Mix 12.5 μL，dd H2O 10.5 μL，總體積25 μL。PCR 反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環；72 ℃再延伸10 min,4 ℃保存。

擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對擴增產物采用DNA片段純化試劑盒純化。

1.5 克隆載體pMD18-F-H重組克隆質粒的構建 將純化的F-H融合基因與pMD-18T Simple Vector進行連接，構建重組克隆質粒pMD18-F-H。并將重組質粒轉化DH 5α，涂布于含Amp 的LB固體培養基中進行篩選，將陽性菌株用小量質粒抽提試劑盒抽提質粒，進行PCR和酶切重組質粒的鑒定。

1.6 乳酸菌表達載體pSIP-F-H的構建與鑒定 將重組克隆質粒pMD18-F-H和乳酸菌表達載體pSIP-409分別以EcoRⅠ和Hind Ⅲ雙酶切，利用凝膠回收純化試劑盒分別回收F-H基因和pSIP-409片段，以T4 DNA 連接酶于16 ℃連接過夜,次日轉化至感受態細胞中。

挑取含em 200 mg/mL LB平板上8～12 h內生長的疑似陽性菌落,分別接種于含em的LB液體培養基中,37℃,180～200 rpm搖床過夜培養,提取質粒,進行PCR和雙酶切鑒定。

1.7 植物乳桿菌NC8的電轉化 取5 μL重組質粒pSIP-F-H加入200μL乳酸菌感受態細胞中,輕輕混勻,移入預冷的電擊杯中冰上靜止5min, 調節電轉化儀電壓為2.0 kV和6 ms,進行電擊。電轉化結束后,取出電擊杯冰上靜止5 min,將轉化物移至800 μL的MRS液體培養基(含0.5 mol/L庶糖)中,30℃靜止厭氧培養3 h。取150 μL菌液涂布于MRS固體培養基(含em 200 mg/mL),30℃靜止厭養培養24-36 h。挑選生長良好的單菌落,接種于5 mL MRS液體培養基(含em 200 mg/mL)中,30℃靜止厭氧培養過夜,乘勝小量質粒提取試劑盒提取乳酸菌質粒,并進行PCR和雙酶切鑒定, 陽性質粒由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.8 CDV F-H蛋白的表達檢測

1.8.1 重組乳酸菌SDS-PAGE檢測 將重組乳酸菌接種于MRS液體培養基(含em 200 mg/mL)中,30℃靜止厭氧培養至OD600約等于0.3時,添加誘導肽SppIP進行誘導培養，于誘導前、誘導后3和6 h取菌液超聲裂解進行SDS-PAGE檢測。同法處理空載體pSIP-409乳酸菌培養作為對照。

1.8.2 重組乳酸菌的Western blot分析 經SDS-PAGE電泳后的表達產物電轉移至PVDF膜后，取出PVDF膜置于封閉液中，37℃封閉1 h。封閉結束后，以洗滌緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次3 min。加入犬瘟熱多克隆抗血清，37℃感作1 h，以洗滌緩沖液洗滌PVDF膜5次，每次3 min。加入HRP標記的羊抗兔IgG二抗，37℃感作1 h，以洗滌緩沖液洗滌PVDF膜5次，每次3 min。加入新配制的DAB顯色液，37℃避光顯色。

3 結果

3.1 F-Linker、 Linker-H 和F-H融合基因的擴增結果 以克隆質粒pMD18T-CDVF和pMD18T-CDVH質粒為模板，分別擴增得到了約860 bp的F-Linker基因(圖1A)、約850 bp的Linker-H基因(圖1B)、約1700 bp的F-H融合基因(圖1C)，與預期擴增的基因大小一致。

3.2 重組克隆質粒pMD18-F-H的PCR 和酶切鑒定結果 以重組質粒pMD18-F-H為模板，進行PCR擴增，得到了約1700 bp的基因片段，與預期大小相符(圖2)。經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，得到了約2700 bp的pMD18-T線性片段和大小約為 1700 bp的目的片段，結果表明，該融合基因已經連接到克隆質粒 pMD-18T Simple vector 上(圖2)。

M.DNA 標準 DL 2000(自上而下：2000,1000,750,500,250,100 bp)圖1 F-Linker、Linker-H和F-H融合基因的擴增結果

M.DNA 標準 DL 2 000(自上而下：2000,1000,750,500,250,100 bp)1.pMD18-F-H EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定 2. pMD18-F-H PCR鑒定圖2 重組克隆質粒的鑒定結果

3.3 重組乳酸菌表達質粒 pSIP-F-H和pSIP-IL-F-H的鑒定結果 以重組乳酸菌表達質粒 pSIP-F-H為模板，進行PCR擴增，得到了約1700 bp的基因片段(圖3A)，與預期大小相符。經EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，得到了pSIP409線性片段和大小約為 1700 bp的目的片段(圖3B)，初步表明，融合基因已經連接到乳酸菌表達載體pSIP409上。陽性重組乳酸菌表達質粒 pSIP-F-H送往上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，結果與水貂源CDV F-H基因序列比對結果完全一致，沒有出現缺失、移位、錯配及突變現象，證實成功地構建了重組乳酸菌表達質粒pSIP-F-H。

3.4 重組融合表達載體在大腸桿菌誘導表達結果 在E.coliBL21(DE3)中，重組表達質粒pSIP-F-H由SppIP誘導表達，經SDS-PAGE電泳分析顯示，重組表達質粒在E.coliBL21 中出現表達產物，表達的融合蛋白大小約為62.96 ku(圖4A),與預測大小相符。

為了進一步鑒定表達產物，將表達的蛋白質經SDS-PAGE后，電轉移至PVDF膜上，以犬瘟熱多克隆抗體為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗，聯苯胺(DAB)為底物，進行western-blot分析，在62.96 ku(圖4B)處分別有一條明顯的蛋白印跡帶，表明經大腸桿菌表達后，表達產物依然具有與CDV 抗血清結合的免疫反應性。3.5 重組融合表達載體在乳酸菌中誘導表達結果 重組表達質粒pSIP-F-H在乳酸菌NC8中經SppIP誘導后，經SDS-PAGE電泳分析顯示，重組表達質粒在乳酸菌中出現表達產物，表達的融合蛋白約為62.96 ku(圖5A),與預測大小相符。

M. 250bp DNA Ladder Marker(自下而上：250、500、750、1000、1500、2250、3000、4500 bp)1. pSIP-F-H PCR鑒定 2. pSIP-F-H EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定圖3 重組乳酸菌表達質粒的鑒定

1. 蛋白質分子量標準(97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4)；2，3. pSIP-F-H在大腸桿菌BL21中表達產物；4.空載體pSIP-409在大腸桿菌BL21中誘導前產物；5.空載體pSIP-409在大腸桿菌BL21中誘導后產物；6.蛋白質分子量標準(180、135、100、75、63、48、35、25、17)；7.pSIP-F-H在大腸桿菌BL21中表達產物圖4 大腸桿菌表達產物的鑒定

為了進一步鑒定表達產物，表達的蛋白質經SDS-PAGE后，電轉移至PVDF膜上，以犬瘟熱多克隆抗體為一抗，HRP標記的山羊抗兔IgG為二抗，聯苯胺(DAB)為底物，進行western-blot分析，在62.96 ku(圖5B)處有一條明顯的蛋白印跡帶，表明經乳酸桿菌表達后，表達產物依然具有與CDV 抗血清結合的免疫反應性。

1，2. pSIP-F-H在乳酸桿菌NC8中表達產物； 3.空載體pSIP-409在乳酸桿菌NC8中誘導前的產物；4. 蛋白質分子量標準(180、135、100、75、63、48、35、25、17)；5.空載體pSIP-409在乳酸桿菌NC8中誘導后的產物；6. 蛋白質分子量標準(97.4、66.2、43.0、31.0、20.1、14.4) ；7. pSIP-F-H在乳酸桿菌NC8中表達產物 圖6 乳酸桿菌表達產物的鑒定

4 討論

隨著毛皮動物養殖業的不斷擴大，集約化、密集程度越來越高，犬瘟熱成為嚴重威脅毛皮動物養殖業的疾病之一。盡管我國在毛皮動物犬瘟熱的診斷和防制上也做了大量的卓有成效的工作，研制成功了犬瘟熱弱毒疫苗和滅活苗，在全國范圍內大面積推廣，并取得了明顯的經濟效益。但是，在實際生產中，犬瘟熱仍時有暴發[8-10]，尤其近幾年來，國內許多地區頻頻出現免疫毛皮動物爆發犬瘟熱的報道[11-12]。由于毛皮動物犬瘟熱發病日趨嚴重，生產上迫切需要有效的防治技術，急需開展深入研究并研制高效的防制技術，有效控制犬瘟熱的發生與流行。

乳酸菌作為機體胃腸道菌群中的益生菌，可調節胃腸道常菌群，保持胃腸道內微生態平衡，增強機體的免疫力，且菌體本身含有的多種成分亦有強大的益生功能[13]，不產生內毒素，菌體表達的外源蛋白不需要純化即可與菌體一起服用，是目前較理想的轉化或表達系統[14-15]。目前乳酸菌作為遞呈肽類、低聚糖和核酸等生物分子載體的研究日益成熟，乳酸菌已成為運載功能分子的重要工具，在介導消化道局部免疫，進而影響全身免疫具有重要作用[16]。胡靜濤等[17]構建了重組鵝源新城疫病毒(NDV)HN基因乳酸桿菌，SDS-PAGE和Western-blot檢測結果表明，構建的HN基因重組乳酸菌可表達與HN蛋白大小相符的條帶，而且該表達蛋白可與NDV陽性抗體發生反應，具有反應原性。蘇君鴻等[18]以乳酸桿菌為載體構建了豬傳染性胃腸炎病毒S基因A、D抗原位點DNA疫苗，具有益生性與免疫預防的雙重功效。本研究以CDV的H基因和F基因為研究對象,采用SEQ-PCR技術擴增CDV的F-H融合基因，成功構建了CDV F-H基因的重組質粒pSIP-F-H，電擊轉入乳酸桿菌NC8中構建重組乳酸工程菌，SDS-PAGE和Western-blot分析結果證實，該重組菌能夠表達CDV的F-H融合蛋白，且該表達蛋白可與CDV的多克隆抗體反應，具有免疫原性，這一研究結論與胡靜濤、蘇群鴻等研究結果一致，即重組乳酸工程菌可作為候選疫苗進一步開發利用。

本研究將疫苗的免疫預防作用與乳酸桿菌的益生作用有機結合起來, 將水貂源犬瘟熱病毒F基因與H基因融合在一起，構建了含有F基因和H基因的重組乳酸工程菌，為以乳酸桿菌為載體的新型疫苗系統的研發以及動物疾病的預防提供新的思路。

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(編輯：陳希)

Construction and Expression of RecombinantLactobacillusContaining F-H Fusion Gene of Canine Distemper Virus from Mink

SU Feng-yan1,LI Zhe1,LI Yan-zhi2,WANG Cun-feng3,ZENG Fan-li1

(1.CollegeofChineseMedicinalMaterials,JilinAgriculturalUniversity,Changcun130118,China;2.AnimalHusbandryWorkStationofYtongManzhuAutonomousCountyinJilinProvince,Jinlin,Ytong130700,China;3.ResearchCenterofAnimalProbioticsEngineeringinJilinProvince,Changcun130118,China)

In order to constructLactobacilluscontaining a F-H fusion gene of canine distemper virus(CDV), the F-H fusion gene was amplified by gene splicing by overlap extension PCR(SOE-PCR).The F-H fusion gene was sub-cloned into shuttle carrier pSIP409 to construct a recombinant plasmid(named as pSIP-F-H).Then the recombinant plasmid pSIP-F-H was elec-transformed intoLactobacillusplantarumcompetence cells. SDS-PAGE and Western-blot were used to detect the expression of F-H fusion protein. In results, the F-H fusion gene of CDV was amplified successfully. The recombinant plasmid pSIP-F-H was constructed and elc-transformed intoLactobacillusplantarumcompetence cells successfully. Results of SDS-PAGE and Western-blot showed that recombinantLactobacillusexpressed a fusion protein (nearly 62.96 ku in size) and the protein can react with CDV positive antibody.

canine distemper virus; F-H fusion gene;Lactobacillus; expression

吉林省重點科技攻關項目(20130206039NY)

蘇鳳艷，博士,教授,從事經濟動物疾病防治方面研究。E-mail:sufy110@163.com

2016-07-29

A

1002-1280 (2016) 09-0015-07

S852.6