基于微流控和機(jī)器視覺(jué)的紅細(xì)胞變形性測(cè)量系統(tǒng)

侯建勛，申世鉉

1 深圳市藥品檢驗(yàn)研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中心），深圳市，518057

2 韓國(guó)高麗大學(xué)機(jī)械工學(xué)系，首爾市，136713，韓國(guó)

基于微流控和機(jī)器視覺(jué)的紅細(xì)胞變形性測(cè)量系統(tǒng)

【作 者】侯建勛1*，申世鉉2

1 深圳市藥品檢驗(yàn)研究院（深圳市醫(yī)療器械檢測(cè)中心），深圳市，518057

2 韓國(guó)高麗大學(xué)機(jī)械工學(xué)系，首爾市，136713，韓國(guó)

紅細(xì)胞變形性主要取決于其細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)的組成成分，包括血紅素及其他成份。現(xiàn)行大部分紅細(xì)胞變形性測(cè)量裝置在測(cè)試后均需清洗過(guò)程，浪費(fèi)人力和時(shí)間。該文介紹了一種基于微流控和機(jī)器視覺(jué)的紅細(xì)胞變形性測(cè)量系統(tǒng)，其采用一次性可拋型微流控測(cè)試通道和傳統(tǒng)的激光衍射法。為了驗(yàn)證該系統(tǒng)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，分別用該系統(tǒng)（RSD）和已成功商用的類(lèi)似系統(tǒng)（LORCA）對(duì)同一健康血樣進(jìn)行紅細(xì)胞變形性測(cè)試，兩者測(cè)得的紅細(xì)胞變形性評(píng)價(jià)指數(shù)（拉伸系數(shù)EI）呈現(xiàn)出很好的一致性。

紅細(xì)胞；變形性；微流控；機(jī)器視覺(jué)

0 引言

紅細(xì)胞的變形性是指紅細(xì)胞在外力作用下改變自身形狀的能力，其主要取決于紅細(xì)胞的幾何結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜和內(nèi)液組成等因素，是直接影響血液循環(huán)尤其是微循環(huán)的重要因素之一，是血液流變學(xué)中重要的研究對(duì)象。多項(xiàng)研究表明，紅細(xì)胞變形性的降低與多種循環(huán)系統(tǒng)疾病存在著重要的聯(lián)系，如動(dòng)脈硬化[1]、血栓癥[1]、糖尿病[2]、高血壓[3]以及貧血[4]等。因此，測(cè)量和研究紅細(xì)胞的變形性對(duì)于預(yù)防醫(yī)學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)具有重要的意義和價(jià)值。

迄今為止，紅細(xì)胞變形性的測(cè)量方法主要有：粘性測(cè)量法、激光衍射法、微管吸吮法、電導(dǎo)法等，其中激光衍射法為目前采用較廣泛、研究最多的方法[5-7]，并已有成功商用機(jī)型，如LoRca(荷蘭R&R公司)和RHeoDYN SSD(德國(guó)Myrenne公司)。本文所述紅細(xì)胞變形性測(cè)量系統(tǒng)也是基于激光衍射法，其基本方法驗(yàn)證及更多實(shí)驗(yàn)研究可參見(jiàn)我們較早發(fā)表的論文[8]，本文主要就利用Labview和NI vision改進(jìn)的基于微流控和機(jī)器視覺(jué)的測(cè)量系統(tǒng)RSD及其方法予以說(shuō)明。

1 方法

1.1 系統(tǒng)原理

本文所述紅細(xì)胞變形性測(cè)量系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱(chēng)RSD)的主要組成部件為：激光二極管(波長(zhǎng)635 nm，功率1.5 mW)、ccD攝像頭、衍射投影屏、壓力傳感器、負(fù)壓裝置以及微流控測(cè)量通道(以下簡(jiǎn)稱(chēng)微通道，由透明聚苯乙烯材料通過(guò)微注塑成型)等，如圖1所示。測(cè)試液為靜脈血紅細(xì)胞由5.5%的PVP磷酸鹽緩沖生理鹽水溶液稀釋至比積（Hct）0.5%所獲得的紅細(xì)胞懸浮液，該比積為現(xiàn)有方法試驗(yàn)條件下，最大限度降低血樣量并保證準(zhǔn)確度的最優(yōu)試驗(yàn)值[5]。測(cè)試開(kāi)始前，將500 μL的測(cè)試液置于微通道左側(cè)的進(jìn)液腔；測(cè)試開(kāi)始時(shí)，與微通道右側(cè)廢液腔由電磁閥相連的負(fù)壓裝置將產(chǎn)生負(fù)壓，電磁閥打開(kāi)，由此產(chǎn)生的壓差將使測(cè)試液流過(guò)微通道(長(zhǎng)：40 mm，寬：4 mm，高：200 μm)。隨著測(cè)試液不斷流向廢液腔，微通道兩側(cè)的壓差逐漸減小直至測(cè)試液停滯流動(dòng)，壓力傳感器將實(shí)時(shí)記錄該壓差，其間，激光二極管(635 nm，1.5 mW)產(chǎn)生的激光穿過(guò)微通道中剪切流動(dòng)的紅細(xì)胞，由此產(chǎn)生的衍射光斑投影到衍射投影屏并由ccD攝像頭實(shí)時(shí)采集。

圖1 RSD測(cè)量系統(tǒng)結(jié)構(gòu)組成圖Fig.1 The schematic of RSD system

如圖2所示，微通道中測(cè)試液所承受剪切力呈指數(shù)減小。測(cè)試開(kāi)始時(shí)，剪切力較高，微通道內(nèi)紅細(xì)胞拉伸程度較大，其衍射光斑呈扁長(zhǎng)橢圓狀；測(cè)試中，隨著剪切力的減小，微通道內(nèi)紅細(xì)胞拉伸程度降低，衍射光斑逐漸趨于圓形；測(cè)試結(jié)束時(shí)，剪切力已近消失，微通道內(nèi)紅細(xì)胞基本無(wú)拉伸，衍射光斑近似圓形。本方法中用來(lái)作為評(píng)價(jià)紅細(xì)胞變形性的變形指數(shù)eI（elongation Index）與LoRca（荷蘭R&R公司）所采用參數(shù)基本一致，已為業(yè)界廣泛接受，且可由下式定義：

將衍射光斑視為橢圓，式中A和B分別為橢圓長(zhǎng)軸和短軸的長(zhǎng)度。基于Labview和NI Vision的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)采集和圖像處理程序可得出A和B并計(jì)算變形指數(shù)EI，因EI為無(wú)量綱參數(shù)，本方法所采用機(jī)器視覺(jué)圖像采集和處理過(guò)程中可省略校準(zhǔn)，全程共耗時(shí)約30 s。

1.2 數(shù)據(jù)處理

由上可見(jiàn)，整個(gè)測(cè)試過(guò)程得到的是沿同一時(shí)間軸實(shí)時(shí)變化的一組壓力數(shù)據(jù)和一組衍射光斑圖像。壓力數(shù)據(jù)是指廢液腔（由膠塞密封且經(jīng)由電磁閥與負(fù)壓裝置可控相通）與進(jìn)液腔（與大氣相通）間的壓差，由壓力傳感器實(shí)時(shí)測(cè)量采集，測(cè)得數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算可得出微通道內(nèi)測(cè)試液所承受的平均剪切力。該計(jì)算過(guò)程可自編程后在Labview中調(diào)用code Interface Node來(lái)實(shí)現(xiàn)，基于現(xiàn)行設(shè)計(jì)，微通道中剪切力范圍為0～30 Pa。

圖2 紅細(xì)胞變形衍射光斑Fig.2 Diffraction patterns of RSD

圖3 橢圓擬合及邊界點(diǎn)獲取過(guò)程圖Fig.3 operation for ellipse ftting and boundary points catching

圖4 RSD測(cè)量系統(tǒng)控制軟件用戶界面Fig.4 User interface of RSD program

衍射光斑圖像在剪切力較高時(shí)呈現(xiàn)扁長(zhǎng)橢圓形，隨著剪切力的逐漸降低而趨于圓形，其圖像處理基于NI Vision模塊提供的各種圖像處理函數(shù)，主要有以下三個(gè)過(guò)程：首先，利用clamp函數(shù)從水平和垂直兩個(gè)方向上獲取橢圓邊界點(diǎn)，見(jiàn)圖3；其次，將這些邊界點(diǎn)輸入到ellipse fitting函數(shù)中進(jìn)行橢圓擬合，并得到擬合所得橢圓的長(zhǎng)短軸數(shù)據(jù)；最后，利用前面所述公式計(jì)算EI。以上過(guò)程均可由Labview模塊化編程自動(dòng)完成，并經(jīng)由用戶界面顯示數(shù)據(jù)、繪制圖線、打印結(jié)果，見(jiàn)圖4。

表1 同一血樣通過(guò)RSD和LoRca測(cè)得eI平均值的對(duì)比分析*Tab.1 Mean values of eI for normal red blood cells measured with RSD and LoRca*

2 對(duì)比及結(jié)論

為了驗(yàn)證本系統(tǒng)的準(zhǔn)確性，同一靜脈血樣同時(shí)在RSD和LoRca上進(jìn)行了紅細(xì)胞變形性測(cè)試，其結(jié)果見(jiàn)圖5。兩臺(tái)設(shè)備測(cè)試方法均基于激光衍射法，數(shù)據(jù)處理算法和系統(tǒng)結(jié)構(gòu)存在顯著不同，但測(cè)試結(jié)果卻十分吻合。此外，為進(jìn)一步驗(yàn)證本系統(tǒng)的重復(fù)性，同一靜脈血樣在RSD和LoRca上分別進(jìn)行了10次紅細(xì)胞變形性測(cè)試，并對(duì)所得EI平均值進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果見(jiàn)表1。可見(jiàn)兩臺(tái)設(shè)備上獲得的測(cè)試數(shù)據(jù)十分接近，隨著剪切力的增加，EI平均值的變異系數(shù)CV值均呈下降趨勢(shì)，且從剪切力大于1 Pa開(kāi)始，兩組數(shù)據(jù)的相對(duì)誤差在2.7%以內(nèi)。基于激光衍射法設(shè)計(jì)的紅細(xì)胞變形性測(cè)試裝置廣泛采用剪切力為3 Pa時(shí)的EI值為評(píng)價(jià)紅細(xì)胞變形性的關(guān)鍵指標(biāo)，RSD和LoRca的測(cè)試結(jié)果在此指標(biāo)位置分別為0.296和0.298（見(jiàn)表1），相對(duì)偏差在1%以內(nèi)，十分接近。

圖5 同一血樣基于RSD與LoRca測(cè)試結(jié)果的對(duì)比Fig.5 comparison of EI for normal sample measured with RSD and LoRca

基于以上對(duì)比，可見(jiàn)RSD與已成功商用機(jī)型LoRca的表現(xiàn)十分相近，具有很好的一致性、準(zhǔn)確性和重復(fù)性。而其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在：①與LoRca所采用的杯狀固定測(cè)試容器相比，RSD采用由透明聚苯乙烯材料通過(guò)微注塑成型的一次性可拋微流控測(cè)試通道，價(jià)格低廉，測(cè)試完畢可直接作為醫(yī)用廢棄物處理，不需要清洗，避免樣品交叉干擾，并減少測(cè)試人員勞動(dòng)強(qiáng)度，提高工作效率；②一次測(cè)試僅需不到5 μL血樣，可使用血糖儀一次性采血針獲得，樣品準(zhǔn)備過(guò)程操作簡(jiǎn)單，且一次測(cè)試耗時(shí)在30 s以內(nèi)；③機(jī)型結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，造價(jià)成本相對(duì)較低，有助于紅細(xì)胞變形性即時(shí)檢驗(yàn)（PocT）走進(jìn)中小醫(yī)療機(jī)構(gòu)，在糖尿病、心腦血管疾病診斷方面發(fā)揮作用。

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The Erythrocyte Deformability Measuring System Based on Microfuidic and Machine Vision

【 Writers 】HOU Jianxun1, SHIN Sehyun2
1 Shenzhen Institue for Drug Control (Shenzhen Testing Center of Medical Devices), Shenzhen, 518057
2 School of Mechanical Engineering, Korea University, Seoul, 136713, Korea

erythrocyte, deformability, microfuidic, machine vision

R 318.11

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2016.03.005

1671-7104(2016)03-0173-03

2016-02-19

侯建勛，博士，e-mail: houhit@qq.com

【 Abstract 】The erythrocyte deformability mainly depends on the composition of the membrane and cytoplasm, which consist of hemoglobin and other constituents. The most of current devices to measure erythrocyte deformability require washing process after the measurement which is labor-intensive and time-consuming. This article introduces an improved measuring system based on microfuidic and machine vision (RSD) which adopts disposable microfuidic channel and conventional laser-diffraction technique to determine erythrocyte deformability. To validate the accuracy and repeatability of RSD, several experiments are conducted to determine deformability of normal erythrocytes measured by RSD and a conventional ektacytometer(LORCA). The measured Elongation Index (EI) by RSD, which is a parameter directly related to erythrocyte deformability, is in excellent agreement with it measured by LORCA.