乳酸菌Lactobacillus sp. strain 2-3厭氧發酵蜂花粉的工藝優化

王 聰,黃 艷,馬詩淳,鄧 宇,郭 軍,吳正云

(1.四川大學輕紡與食品學院,四川成都 610065;2.農業部沼氣科學研究所,四川成都 610041;3.農業部可再生能源開發與利用重點實驗室,四川成都 610041;4.昆明理工大學生命科學與技術學院,云南昆明 650504)

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乳酸菌Lactobacillussp. strain 2-3厭氧發酵蜂花粉的工藝優化

王 聰1,2,3,黃 艷2,3,馬詩淳2,3,鄧 宇2,3,郭 軍4,吳正云1,*

(1.四川大學輕紡與食品學院,四川成都 610065;2.農業部沼氣科學研究所,四川成都 610041;3.農業部可再生能源開發與利用重點實驗室,四川成都 610041;4.昆明理工大學生命科學與技術學院,云南昆明 650504)

為提高蜂花粉的營養價值,將從蜂糧中分離獲得的乳酸菌Lactobacillussp. strain 2-3用于蜂花粉厭氧發酵,以活菌數、感官評分作為主要考察指標,在單因素基礎上對蜂花粉厭氧發酵工藝進行優化,通過對正交實驗的9個實驗組的乳酸菌活菌數、感官評分、總黃酮、總酚、DPPH自由基清除率、甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、還原糖等指標進行檢測,對實驗結果進行顯著性分析和相關性分析,選取代表性指標活菌數、感官評分、異丁酸進行正交優化分析,確定乳酸菌厭氧發酵蜂花粉的最優工藝。結果表明,蜂花粉厭氧發酵的最優發酵工藝為:水分添加量50%、發酵溫度37 ℃、乳酸菌接種量10%、發酵時間48 h,發酵蜂花粉活菌數可達54.90×108cfu/g,感官評分為13.33,異丁酸含量3.60 mg/g。此外,總黃酮、總酚和DPPH自由基清除率相較于對照組分別提高了94.17%、83.75%、106.45%;揮發酸的種類更加豐富,產生了丁酸和異丁酸,總揮發酸含量也增加到167.80 mg/g;還原糖含量增至48.70%。結果表明蜂糧源乳酸菌可以應用于蜂花粉發酵,提高了蜂花粉營養價值。

厭氧發酵,乳酸菌,抗氧化,揮發酸,還原糖

蜂花粉(Bee Pollen)是蜜蜂采集花粉后,將其和花蜜等混合而成的顆粒狀物質[1],通過乳酸菌等在巢脾中發酵最終成為蜂糧[2-3]。蜂花粉富含蛋白、核酸、維生素等多種營養成分[4],同時也含有黃酮、總酚等抗氧化活性成分[5],近代科學研究和臨床應用充分肯定了蜂花粉的醫療保健作用,蜂花粉具有抗疲勞、增強記憶力的作用[6],且對心腦血管疾病、糖尿病、哮喘等均有一定的治療作用[7]。近年來,花粉已成為風靡世界的營養食品,越來越受到人們的重視。

圖1 蜂花粉發酵工藝Fig.1 The fermentation technology of bee pollen

目前蜂花粉在食品領域中的應用主要是直接食用或粉碎后壓成片劑或膠囊[8],但花粉堅硬的外壁阻止人體對其營養成分的吸收,必須進行特殊的破壁處理才能使營養成分大量釋放出來[9]。有報道稱,通過微生物破壁法可以使蜂花粉破壁還可以將內容物中的大分子物質降解成小分子物質,變得更容易被人體吸收,具有操作方便、加工流程簡單、破壁率高等優點[10]。乳酸菌是食品發酵中的常用菌種,可賦予食品一定的風味,提高發酵制品的營養價值、防止腐敗變質、抑制病原菌生長,并賦予特別的香氣和滋味[11]。此外,乳酸菌還具有降低膽固醇、調節腸胃功能、改善免疫狀況等功能[12]。楊文超等[13]嘗試將蜂糧源乳酸菌應用到蜂花粉中,由于其利用的是好氧乳酸菌發酵,在蜂花粉中發酵性能較差,需先加紅曲霉預發酵再接種乳酸菌。

本研究所采用的研究對象Lactobacillussp. strain 2-3分離自西方蜜蜂的蜂糧,以2%(v/v)的接種量37 ℃下培養36 h后,菌液可產生高達9107.88 mg/L的乳酸,在食品開發中具有良好的應用潛力。本研究將蜂糧源厭氧乳酸菌用于蜂花粉發酵中,利用單因素實驗和正交實驗對其發酵蜂花粉的工藝參數進行了優化,以期達到簡化蜂花粉發酵工藝、提高蜂花粉營養成分、增加抗氧化活性物質、改善蜂花粉口感的目的。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

乳酸菌:Lactobacillussp. strain 2-3西方蜜蜂蜂糧源乳酸菌;油菜花粉 購買于汪氏蜜蜂園。

MRS培養基(Thermo Fisher Oxoid);刃天青(SIGMA-ALDRICH,≥99.0%);L-半胱氨酸鹽酸鹽·一水(SIGMA-ALDRICH,≥99.0%)。

80i熒光相差顯微鏡 Nikon;VARIOSKAN FLASH酶標儀 Thermo;J2-21高速冷凍離心機 Beckman;7890A氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司;1200高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂花粉發酵的工藝流程 流程圖工藝如圖1所示。

1.2.2 水分、溫度、接種量和發酵時間對發酵蜂花粉活菌數和感官品質影響的單因素考察 水分添加量分別取40%、50%、60%、70%、80%(v/v),發酵溫度20、30、37、40、50 ℃,乳酸菌接種量5%、10%、15%、20%、25%(v/v),發酵時間0、24、48、72、96 h,厭氧發酵結束后測定活菌數并進行感官評價。

1.2.3 正交實驗 根據單因素實驗結果,選擇水分添加量、乳酸菌接種量、發酵溫度、發酵時間做L9(34)四因素三水平正交優化實驗,因素水平表見表1。對照組CK的實驗條件根據單因素實驗結果,水分添加量取60%,溫度取37 ℃,發酵時間48 h,不接種乳酸菌。

表1 發酵工藝正交實驗因素水平表
Table 1 Factors and levels for orthogonal arry design

水平因素A水分添加量(%)B發酵溫度(℃)C乳酸菌接種量(%)D發酵時間(h)15030524260371048370401572

檢測各實驗組和對照組的活菌數、總黃酮、總酚、DPPH自由基清除率、代謝產物產量(甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、還原糖),并對其進行感官評分。

1.2.4 顯著性和相關性分析 采用IBM SPSS 22.0軟件對所測14個指標進行顯著性和相關性分析,選取代表性指標進行正交優化分析,以得出蜂花粉的最優厭氧發酵方案。

圖2 水分添加量、發酵溫度、接種量和發酵時間對發酵蜂花粉活菌數和感官品質影響Fig.2 Effects of water,fermentation temperature,seed solution,fermentation time on the living bacterium,sensory value

1.3 測定方法

1.3.1 揮發酸的測定 準確稱取0.10 g發酵后蜂花粉于1.5 mL EP管中,添加0.9 mL的ddH20,13000 r/min離心10 min,取上清,加10 μL濃H2SO4,冰浴30 min后再次離心,取上清于樣品瓶中,待測。其中乳酸、甲酸、乙酸、丙酸用液相色譜直接測定;而丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸的測定需在加10 μL濃H2SO430 min后再加入30 μL的甲酸,冰浴30 min后離心,取上清于樣品瓶中,用氣相色譜測定。

1.3.2 乳酸菌的活菌數計數 準確稱取1.0 g發酵后的蜂花粉,十倍稀釋法制得適宜稀釋度的樣品稀釋液。選擇2～3個適宜稀釋度,分別吸取1 mL,傾注法接種到MRS厭氧培養基中,37 ℃厭氧培養48 h(每個稀釋度做兩個平板)。選取菌落總數在30～300 cfu/g之間的平板計數,取平均值[14](整個操作在厭氧條件下進行)。

1.3.3 抗氧化指標的測定 總黃酮的測定采用絡合分光光度法,參考陳南迪等[15],樣品預處理時不做超聲處理;總酚的測定采用Folin-Ciocaileu比色法[16];DPPH自由基清除能力的測定參考孫麗萍等[17]。

表2 發酵蜂花粉感官評分標準
Table 2 The sensory scoring criteria of fermented bee pollen

項目優質(5～4分)較好(4～3分)較差(2～1分)色澤金黃色，無顆?；ǚ埸S褐色，無顆粒花粉淺褐色、有顆?；ǚ蹥馕断銡饷黠@香氣較弱有其他難以接受的異味滋味酸甜適口，無苦澀味有酸味，略有苦澀味無酸味，有苦澀味

1.3.4 糖的測定 還原糖的測定采用DNS法[18]。

1.3.5 感官評分標準 對發酵完成的蜂花粉進行感官評分[13],由20名專業人員組成評定小組,以發酵蜂花粉的色澤、氣味和滋味為主要評價指標,每個指標滿分為5分,總分為15分。評分標準見表2。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

水分添加量、發酵溫度、乳酸菌接種量和發酵時間對發酵蜂花粉活菌數和感官品質影響的單因素考察結果,見圖2A～圖2D。

由圖2A、2B可以看出,隨著水分添加量、發酵溫度的增加,發酵蜂花粉的活菌數、感官評分均呈現先增后減的趨勢。水分添加量為60%時活菌數、感官評分均達到最大值,分別為6.93×108cfu/g和13.00,添加量大于60%,花粉的營養成分被過度稀釋,不利于乳酸菌的生長;發酵溫度為37 ℃時活菌數和感官評分達到峰值,分別為15.6×108cfu/g和13.45,當溫度達到50 ℃,蜂花粉顏色由金黃色變成褐色,部分營養物質發生質變,活菌數和感官評分均急劇下降,因此適宜發酵溫度為37 ℃;由圖2C可以看出,發酵蜂花粉的活菌數隨接種量的增加而升高,且在5%～10%之間增幅較明顯,增至18.70×108cfu/g,大于10%后增加幅度不大,且口感過酸,感官評分反而降低,從經濟角度和適口性考慮,選擇乳酸菌的接種量為10%較為合適;圖2D顯示發酵蜂花粉的活菌數、感官評分隨著發酵時間的延長呈先增加后平穩的趨勢,在24～48 h是乳酸菌的對數生長時期,增幅最明顯,分別增至31.60×108cfu/g和13.51,48～96 h之間增幅并不明顯,而發酵時間延長會增加經濟成本和時間成本,因此最適發酵時間為48 h。

表3 正交實驗結果
Table 3 The results of orthogonal array experiment

實驗號CK1234活菌數(108cfu/g)0001440±007e5490±008a3250±018c4500±007b感官評分700±011e933±105d1333±026a1067±049b967±087c總黃酮(mg/g)1201±111f1250±109e2332±021a2196±081a2184±151b總酚(mg/g)480±015d778±012b882±027a857±016a863±052aDPPH自由基清除率(%)2372±097e3675±101d4897±032a5062±172a4136±079c乳酸(mg/g)1571±064g3682±022e8347±547a5322±078b2816±071f甲酸(mg/g)653±008f678±004e1241±007a1133±003b1047±058c乙酸(mg/g)1799±143e681±001f2655±066c2397±01d1866±006e丙酸(mg/g)665±063f877±142e3707±167a1342±041c1298±091d異丁酸(mg/g)000159±003d360±077b245±008c406±006a丁酸(mg/g)000113±001d119±004c131±002a118±001c異戊酸(mg/g)118±004f141±006d163±005c237±016a195±009b戊酸(mg/g)045±004f184±001c189±003b180±002c199±005a還原糖(%)1987±102h3135±05g4870±042b4087±161d4516±015c實驗號56789活菌數(108cfu/g)5570±026a990±006g1180±003f1960±007d1220±001h感官評分1100±055b1000±079b867±022d600±038e767±027e總黃酮(mg/g)2221±072a1521±070d1622±012d1390±094e1868±040c總酚(mg/g)830±070a721±054c688±056c719±011c692±036cDPPH自由基清除率(%)442±106b3773±089d4002±299c4308±092b3563±141e乳酸(mg/g)5101±061b4814±127c3512±15e4224±247d5104±051b甲酸(mg/g)693±041e1211±005a893±024d1185±061b686±011e乙酸(mg/g)681±008g2435±037d3615±076a3408±017b645±008g丙酸(mg/g)1349±041c3491±035b1499±16c3325±048b1255±054d異丁酸(mg/g)198±003d212±028c23±003c157±006d162±002d丁酸(mg/g)123±001b118±001c116±001c117±002c117±001c異戊酸(mg/g)126±002d238±008a171±015c135±011d125±002e戊酸(mg/g)109±001e181±002c173±003d177±002d109±001e還原糖(%)4388±08c5137±067a3319±089f3258±112f3658±096e

注:同行數據出現的不同小寫字母上標表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 水分添加量、溫度、接種量和發酵時間對發酵蜂花粉品質影響的正交實驗結果

按表1的正交因素水平設計L9(34)正交實驗,測定9個不同實驗組的活菌數、總黃酮、總酚、DPPH自由基清除率、甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、還原糖,并對其進行感官評分,結果見表3。

由表3可以看出,所測9個實驗組的活菌數、感官評分、總黃酮、總酚、DPPH清除率、甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、還原糖、感官評分與對照組相比均有顯著性差異(p<0.05)。其中,實驗組2活菌數為54.90×108cfu/g;感官評分最高為13.33;抗氧化指標總黃酮、總酚和DPPH自由基清除率和對照組有極顯著性差異(p<0.05),較對照組分別提高了94.17%、83.75%、106.45%;發酵后蜂花粉揮發酸總量達167.80 mg/g,與對照組48.51 mg/g相比有顯著的提高,發酵后的蜂花粉出現了對照組中所沒有的異丁酸和丁酸,表明經過發酵,蜂花粉中揮發酸的種類更加豐富;實驗組還原糖的含量均高于對照組,表明發酵后還原糖含量得到了較顯著的增加。綜合來看,實驗組2差異性最明顯。

2.3 各指標相關性分析

采用IBM SPSS 22.0軟件,對各指標進行相關性分析,分析結果見表4。

表4 各指標相關性分析
Table 4 Correlation analyses between different indexes

項目感官評分活菌數黃酮總酚DPPH甲酸乳酸乙酸丙酸異丁酸丁酸異戊酸戊酸還原糖感官評分1活菌數0738?1黃酮0728?0870??1總酚0733?0831??0772??1DPPH06230740?0735?0888??1甲酸0332030315046506261乳酸0708?058306240636?0724?04851乙酸-0088-0101-0077-004502830706?00731丙酸026702150128027504330816??062605561異丁酸0660?0722?0754?0843??0719?05910487021103451丁酸042204920533823??817??04380587007503560671?1異戊酸041010295041904480681?018403820297051304151戊酸0391032902720724?0688?0706?0376041804780756?0758?0621還原糖0733?0639?0696?0762?0669?06090668?004405660774??0705?060905841

注:*顯著相關(p<0.05);**極顯著相關(p<0.01)。

表5 正交優化
Table 5 The results of orthogonal optimization

實驗號ABCD活菌數感官評分異丁酸綜合指標111110098045400080257212220983100008150956313330493063703530536421230767050110000683522311000068201650666623120000054602210319731320041036402930255832130211000000000061933210050022800200133均值10580039802120352均值20556056105910510均值3015032604820423極差043023503790158

由表4可以看出,發酵蜂花粉活菌數與總黃酮、總酚極顯著相關(p<0.01),與感官評分、DPPH自由基清除率、異丁酸、還原糖顯著相關(p<0.05);感官評分與黃酮、總酚、乳酸、異丁酸、還原糖顯著正相關;異丁酸與總酚、還原糖極顯著相關,與黃酮、DPPH自由基清除率、丁酸、戊酸顯著相關,因此選取感官評分、活菌數、異丁酸3個代表性指標。

2.4 代表性指標正交優化分析

選取活菌數、感官評分、異丁酸含量3個代表性指標做正交優化分析。通過權重法[19]計算得出活菌數、感覺評分和異丁酸含量的權重值分別為0.29、0.5和0.21,并將三個指標的標準化值變換到0～1,計算綜合指標:

綜合指標=活菌數標準化值×0.29+感官評分標準化值×0.5+異丁酸含量標準化值×0.21。

由表5,發酵工藝的最優組合為A1B2C2D2,即水分添加量50%,發酵溫度37 ℃,乳酸菌接種量10%,發酵時間48 h,即為實驗組2,發酵后蜂花粉乳活菌數可達54.90×108cfu/g,感官評分為13.33,異丁酸含量3.60 mg/g。同時,總黃酮、總酚和DPPH清除率相較于對照組分別提高了94.17%、83.75%、106.45%;揮發酸種類更加豐富,總揮發酸含量增加到167.80 mg/g;還原糖含量增至48.70%。

2.5 驗證實驗

水分添加量50%,乳酸菌接種量10%,控制發酵溫度37 ℃,進行蜂花粉發酵實驗,厭氧發酵48 h后產品的乳酸菌活菌數為55.40×108cfu/g;感官評分13.67;總黃酮含量24.41 mg/g;總酚含量8.98 mg/g;DPPH清除率為49.08%;乳酸含量84.32 mg/g;甲酸含量11.89 mg/g;乙酸含量27.22 mg/g;丙酸含量35.52 mg/g;異丁酸含量3.32 mg/g;丁酸含量1.14 mg/g;異戊酸含量1.66 mg/g;戊酸含量1.80 mg/g;還原糖含量49.21%,說明所選最優工藝合理。

3 結論

采用蜂糧源乳酸菌Lactobacillussp. strain 2-3可以對蜂花粉進行厭氧發酵。以活菌數、感官評分為主要考察指標,在單因素基礎上對厭氧發酵工藝進行優化,正交實驗發現9個實驗組的活菌數、感官評分、總黃酮、總酚、DPPH自由基清除率、甲酸、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、還原糖與對照組相比均有顯著性差異(p<0.05),各指標相關性分析后選取活菌數、感官評分、異丁酸3個代表性指標做正交優化分析,最終得到的最優組合為水分添加量50%,發酵溫度37 ℃,乳酸菌接種量10%,發酵時間48 h。厭氧發酵后的蜂花粉酸甜適口,富含益生菌,且提高了蜂花粉的抗氧化活性物質和還原糖含量,豐富了揮發酸的種類和含量,為蜂花粉的產品深開發提供了新思路。

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Optimization of the fermentation conditions of bee pollen with Lactobacillus sp. strain 2-3

WANG Cong1,2,3,HUANG Yan2,3,MA Shi-chun2,3,DENG Yu2,3,GUO Jun4,WU Zheng-yun1,*

(1.College of Light Industry,Textile and Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China; 2.Biogas Institute of Ministry of Agriculture,Chengdu 610041,China;3.Key Laboratory of Development and Application of Rural Renewable Energy,Ministry of Agriculture,Chengdu 610041,China; 4.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650504,China)

To improve the nutrition value of bee pollen,anaerobic lactic acid bacteria(LAB)Lactobacillussp. strain 2-3 from bee bread was used for bee pollen fermentation. The single factor test was studied,using the the number of living LAB and sensory value. Then,the number of living LAB,the sensory score,total flavonoids,total phenol,DPPH clearance,formic acid,lactic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid,isobutyric acid,valeric acid,isovaleric acid and revertose of the orthogonal 9 experiment group were tested. After the correlation analysis of indexes,representative indicators including the number of living LAB,the sensory score,isobutyric acid were selected to investigate the optimal anaerobic fermentation technology of bee pollen. The results showed that the optimal anaerobic fermentation technology of bee pollen was moisture of 50%,fermentation temperature of 37 ℃,LAB seed solution of 10%,fermentation time of 48 h,under this condition,the number of living LAB of fermented bee pollen was 54.90×108cfu/g,the highest sensory value was 13.33,and the isobutyric acid content was 3.60 mg/g. Besides,the flavonoids,total phenol and DPPH clearance of the optimum condition were increased by 94.17%,83.75% and 106.45%,respectively comparing with the control groups,the kinds of volatile acid was enriched with butyric acid and isobutyric acid,and the total content of VFA was increased to 167.80 mg/g,revertose content was increased to 48.70%. The results suggested that the LAB from bee bread was appropriate to apply to bee pollen,the nutrition value of bee pollen was improved.

Anaerobic;LAB;Antioxidant;Volatile acid;Revertose

2016-06-23

王聰(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：wangcong909209@sina.com。

*通訊作者:吳正云(1970-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生態工程與生物技術，E-mail：wuzhengyun@scu.edu.cn。

中國農業科學院科學與技術創新工程項目；四川省科技基礎條件平臺項目(TJPT20160013)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)23-0119-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.014