QuEChERS/液相色譜串聯質譜法測定水產品中氯硝柳胺

劉伶俐,萬譯文,伍遠安,索紋紋,肖 維

(1.農業部漁業產品質量監督檢驗測試中心(長沙),湖南長沙 410153;2.湖南省水產科學研究所,湖南長沙 410153;3.水產健康生產湖南省協同創新中心,湖南常德 415000)

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QuEChERS/液相色譜串聯質譜法測定水產品中氯硝柳胺

劉伶俐1,萬譯文2,*,伍遠安3,索紋紋1,肖 維1

(1.農業部漁業產品質量監督檢驗測試中心(長沙),湖南長沙 410153;2.湖南省水產科學研究所,湖南長沙 410153;3.水產健康生產湖南省協同創新中心,湖南常德 415000)

本文建立了QuEChERS/液相色譜-質譜/質譜(HPLC-MS/MS)測定水產品中氯硝柳胺殘留量的分析方法。樣品經氨化乙腈提取,C18吸附劑與中性氧化鋁凈化后,采用HPLC-MS/MS選擇反應監測(SRM)負離子模式測定進行定性、定量分析。結果表明:在0.5～100 ng/mL范圍內,峰面積與濃度線性良好,相關系數為0.9996;氯硝柳胺檢出限(LOD)為0.2 μg/kg,定量限(LOQ)為0.4 μg/kg,檢測結果的相對標準偏差為4.33%～9.91%(n=5),平均加標回收率達到74.6%～92.1%。該方法具有較高的適用性和選擇性,在水產品中氯硝柳胺的殘留測定中具有很好的應用前景。

氯硝柳胺,QuEChERS,液相色譜-質譜/質譜法,水產品

氯硝柳胺(Niclosamide,NIC),又名殺螺胺,是一種有效的殺蟲劑,也是一種人工合成的殺螺藥物[1-2],可以有效的殺滅動物體內的寄生蟲和絳蟲,是世界衛生組織自1972年來唯一推薦使用的滅螺藥,目前國家尚未有氯硝柳胺在食品中的限量要求,其主要用于防治血吸蟲[3]。由于該藥物對魚類有劇毒,會造成魚類的死亡[4-5],因此在水產養殖過程中,漁民采用該藥物清塘,滅殺雜魚,由于效果顯著,在水產上逐步被推廣開來,因此在水產上的使用量越來越大。

目前國內外已經研制出的氯硝柳胺測定分析方法主要有生物測定法、滴定法、電化學分析法(electrochemical analysis)、紫外-可見分光光度法(UC)、液相色譜(HPLC)、氣相色譜(GC)、液質聯用(HPLC-MS)、氣質聯用(GC-MS)法等[6-11]。目前應用較多的色譜法中,由于氣相法與氣質聯用法需要衍生化,來提高分析的敏感性,前處理步驟較為繁瑣,耗時較長。而采用液相色譜法通過不同溶劑來選擇性分離氯硝柳胺,可得到較好的分離效果。采用液質聯用法更適用于檢測極性化合物而不需要衍生,相對于液相色譜法而言,能進一步降低了檢出限,提高靈敏度和選擇性,更適合于基底復雜的生物材料中氯硝柳胺的痕量檢測。

水產品成分較為復雜,基質中含有大量的蛋白質、脂肪以及色素等雜質,氯硝柳胺作為親脂性物質,與水產品的脂肪緊密結合。QuEChERS方法是一種快速、簡單、經濟、抗干擾、安全的樣品前處理方法,其原理是利用吸附劑填料與基質中的雜質相互作用,吸附雜質達到除雜凈化的目的[12-14]。本文通過采用QuEChERS技術進行樣品處理,通過對實驗條件的篩選和實驗方法的改進,利用液相色譜-質譜法聯用來測定水產品中的氯硝柳胺,縮短了前處理時間,靈敏度高,能實現藥物殘留的快速檢測,能滿足水產品質檢以及相關基礎研究的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氯硝柳胺標準品 純度>98%,湖南省藥物研究所;甲醇 色譜純,德國Merck公司;乙腈 色譜純,德國Merck公司;乙酸乙酯 色譜純,德國Merck公司;C18吸附劑 70～230目,上海安譜科學儀器有限公司;無水硫酸鎂 分析純,Adamas試劑公司;中性氧化鋁 分析純,Alfa Aesar天津化學有限公司。

實驗用水應符合GB/T 6682中一級水的規定。所用試劑除另有指定外,均為分析純。TSQ QUANTUM液相色譜-質譜聯用儀 美國賽默飛世爾公司;分析天平 梅特勒-托利多儀器上海有限公司,感量0.0001 g;高速冷凍離心機 日本日立公司;試管震蕩混勻器 美國,Fisher;步琪平行蒸發儀 瑞士buchi公司;氮氣吹掃儀 美國Organomation公司。

1.2 樣品預處理

取樣品5.00 g(精確到0.01 g)置于50 mL離心管中,加入10 mL氨化乙腈(pH9～10),在漩渦混合儀上充分混合2 min,超聲提取10 min,以6000 r/min離心10 min,取上清液于25 mL比色管中,殘渣中再次加入10 mL氨化乙腈(pH9～10),重復提取1次,合并2次提取液于25 mL比色管中,用乙腈定容至刻度。

取上述提取液5 mL于10 mL離心管中,置45 ℃氮吹至干,加入1 mL 90%乙腈水溶液渦旋溶解殘留物,將0.5 g C18吸附劑及0.2 g中性氧化鋁加入到離心管中,渦旋混勻,充分吸附樣品中的雜質和色素,10000 r/min離心8 min,取上清液經0.2 mm濾頭過濾至進樣瓶中,HPLC-MS/MS測定。整個樣品處理過程要求避光。

1.3 標準系列測定

精確稱取約5.0 mg氯硝柳胺于50 mL容量瓶中,用乙腈在超聲水浴中溶解,放冷,用乙腈定容,可得到0.1 mg/mL的氯硝柳胺標準儲備液。

取氯硝柳胺標準儲備液適量,用甲醇逐級稀釋成最終濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 μg/L的標準應用液系列;分別取各標準溶液進樣,以峰面積為縱坐標,濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

1.4 液相色譜-質譜聯用儀條件

1.4.1 色譜條件 Hypersil Gold柱(150 mm×2.1 mm,3 μm),柱溫:40 ℃;進樣量為10 μL;流動相:80%乙腈+20%水,流量0.3 mL/min。

1.4.2 質譜條件 采用大氣壓電噴霧離子源(ESI),負離子模式;噴霧電壓為-3000 V;離子傳輸毛細管溫度為350 ℃,Q1半峰寬為0.7Da;Q3半峰寬為0.7Da;碰撞氣氬氣壓力為1.5 mTorr;鞘氣流量為12 L/min;輔助氣流量為2 L/min;采用選擇反應監測模式(SRM)。氯硝柳胺質譜采集參數如表1。

表1 氯硝柳胺質譜采集參數
Table 1 MS/MS acquisition parameters for Niclosamide

母離子(m/z)子離子(m/z)碰撞能量(V)起始時間(min)結束時間(min)Tubelens32511352420805332511710300805332518928901908053

1.5 結果計算

試樣中氯硝柳胺殘留量按公式(1)計算,計算結果需扣除空白值,結果保留3位有效數字。

式(1)

式中:X-樣品中氯硝柳胺殘留量(μg/kg);C-樣品溶液中氯硝柳胺的測量濃度(μg/mL);V-樣品溶液最終定容體積(mL);m-樣品稱樣量(kg)。

1.6 數據處理方法

樣品的濃度值采用標準曲線定量得到,標準曲線采用Microsoft Excel 2010進行計算和繪制。

2 結果與討論

2.1 流動相的組成對分離效果的影響

實驗分別嘗試0.1%的甲酸水溶液和乙腈(V∶V=20∶80)、甲醇和0.1%的甲酸水溶液(V∶V=80∶20)、乙腈和0.1%的氨水水溶液(V∶V=80∶20)、甲醇和0.1%的氨水水溶液(V∶V=80∶20)以及乙腈和水(V∶V=80∶20)作流動相,結果發現,在流動相中無論加入酸或堿,均會導致出峰時間嚴重漂移,出峰面積不穩定。這可能與氯硝柳胺的性質有關,氯硝柳胺pKa值為7.3,是兩性化合物[15],因此無論是在酸性還是堿性條件下,均出現離子化不穩定的情況。而乙腈和水作為流動相時出峰峰形良好,且保留時間穩定,最終確定為流動相。

2.2 提取溶劑的選擇

常用的提取溶劑有甲醇、乙腈和乙酸乙酯等,本文比較了甲醇、氨化乙腈(pH9～10)和乙酸乙酯在提取水產品中氯硝柳胺上的不同,采用甲醇和氨化乙腈(pH9～10)作為提取劑時,能較好的沉淀水產品中蛋白質,通過高速離心后容易去除,蛋白質含量低，有利于下一步過程中QuEChERS凈化,而采用乙酸乙酯提取時,對水產品中的雜質提取較多,在氮吹時殘留雜質不容易吹干,影響目標物回收率。而乙腈與甲醇相比,乙腈的滲透性更強,提取效果更佳,可使得氯硝柳胺的回收率更高,因此本文采用氨化乙腈作為目標物的提取劑,是由于氯硝柳胺在堿性環境中更易溶解。

表1 氯硝柳胺線性范圍和檢出限
Table 1 The linear range and detection limit of Niclosamide

藥物線性范圍(μg/L)回歸方程相關系數檢出限(μg/kg)定量限(μg/kg)氯硝柳胺05～100Y=50244x+27890099960204

2.3 凈化方式的選擇

水產品常用的凈化方式有使用正己烷、固相萃取柱以及QuEChERS凈化。QuEChERS采用的是分散型固相萃取進行凈化,常用的吸附劑有C18、PSA(乙二胺-N-丙基硅烷)、弗羅里硅土、中性氧化鋁及石墨化炭黑(GCB)。吸附劑的選擇和用量主要根據不同的樣品基質來決定,考慮到水產品含有大量的脂肪及蛋白質且氯硝柳胺為兩性化合物,本文選擇C18、中性氧化鋁的組合作為吸附劑,這是由于C18和中性氧化鋁均為常用的吸附劑,常用于非極性到中等極性物質的吸附,具有良好的除脂能力。結果表明:當采用0.5 gC18吸附劑及0.2 g中性氧化鋁作為分散型固相萃取吸附劑時,溶液清亮,基質干擾小。該方法可提高實驗效率,降低成本,還有效地提高了回收率。

2.4 質譜條件的選擇

根據目標物的結構特征,實驗選用電噴霧ESI負離子電離模式,以流動注射泵連續進樣(1.0 mg/L)進行一級質譜全掃描,掃描范圍在200～400之間,得到一級質譜圖和分子離子([M-H]-)峰為母離子,將該母離子進行二級質譜掃描,找出豐度最強的碎片離子為定量離子,豐度次強的碎片離子為定性離子。在此基礎上對錐孔電壓、碰撞能量及離子源溫度進行優化,使其分子離子與特征碎片離子產生的離子對強度最大時為最佳,用于后續的定性及定量工作。得到1.4.2中最佳質譜條件。

在“1.4液相色譜-質譜聯用儀條件”下對氯硝柳胺標準溶液進樣,得到了比較理想的色譜峰,峰形尖銳且對稱性好,增大了分子離子峰的峰強度,氯硝柳胺標準溶液的多反應監測色譜圖見圖1。

圖1 氯硝柳胺標準溶液(10 ng/mL)的多反應監測色譜圖Fig.1 SRM chromatogram of Niclosamide(10 ng/mL)

2.5 標準曲線及檢出限

將配制的不同濃度的標準溶液,在1.4液相色譜-質譜聯用儀條件下進行測定,以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線,結果表明,氯硝柳胺濃度在0.5～100 μg/L范圍內,濃度與峰面積呈良好的線性關系。在魚、蝦、蟹等陰性樣品中添加氯硝柳胺標準溶液(添加水平為0.2 μg/kg)經測定信噪比(S/N)均大于3,表明該物質的檢測下限(LOD)為0.2 μg/kg,在魚、蝦、蟹等陰性樣品中添加氯硝柳胺標準溶液(添加水平為0.4 μg/kg)經測定信噪比(S/N)均大于10,表明其定量下限(LOQ)可為0.4 μg/kg。線性方程、相關系數、檢出限和定量限列于表1。

2.6 精密度與準確度

采用在草魚、對蝦及中華鱉陰性樣品中添加標準物質的方法,在1.0、2.0、10.0 μg/kg 3個濃度水平進行加標回收實驗,每個濃度水平重復5次,方法回收率與精密度數據列于表2。由表2中可見,氯硝柳胺平均回收率在74.6%～92.1%之間,相對標準偏差在4.33%～9.91%之間,說明本方法的準確度和精密度良好。

表2 空白樣品中氯硝柳胺加標回收率及精密度(n=5)
Table 2 Fortified recoveries and precision of Niclosamide in blank samples

藥物添加濃度(μg/kg)平均回收率(%)相對標準偏差(%)氯硝柳胺1074686220883991100921433

2.7 實際樣品測定

運用本文建立的方法對市場中的20個水產品樣品進行了分析檢測,樣品均未檢出氯硝柳胺。結果表明:該方便簡單、快速,具有很好的適用性和可操作性,譜圖無干擾。

3 結論

本文建立了QuEChERS/液相色譜串聯質譜法測定水產品中氯硝柳胺含量的檢測方法。該法具有靈敏、準確、簡便、快速等優點,能滿足水產品中氯硝柳胺殘留監控的要求,可為氯硝柳胺在水產品中的消除規律及毒理評價提供靈敏、準確的分析手段,對食品的安全工作提供了有力的保障。

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Simultaneous determination of niclosamide in aquatic products by QuEChERS/liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LIU Ling-li1,WAN Yi-wen2,*,WU Yuan-an3,SUO Wen-wen1,XIAO Wei1

(1.Fishery Products Quality Supervision and Testing Center,Ministry of Agriculture,Changsha 410153,China; (2.Hunan Fisheries Science Institute,Changsha 410153,China; (3.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province,Changde 415000,China)

To establish an analytical method for the determination of niclosamide in aquatic products by QuEChERS/liquid chromatography-tandem mass spectrometry,the sample was extracted with acetonitril,the extract was cleaned up with C18and Alumina-N,the mass spectrometer was operated in the negative ion mode using selected reaction monitoring for the qualitative and quantitative analysis. The linear ranges were from 0.5 to 100 ng/mL with a good linear relationship(R2=0.9996). The detection limits of this method for niclosamide residues were 0.2 μg/kg,and the limits of quantification were 0.4 μg/kg. The relative standard deviations ranging from 4.33%～9.91%(n=5)and the average recovery rates were from74.6%～92.1%. The method proposed by this paper possessed higher applicability and selectivity. It is promising in real applications of determining the niclosamide residues in aquatic products.

niclosamide;QuEChERS;liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry;aquatic products

2015-12-16

劉伶俐(1981-)，女，碩士研究生，主要從事食品質量與環境分析化學工作，E-mail:25646858@qq.com。

*通訊作者:萬譯文(1984-)，男，碩士，講師，研究方向：水產品質量安全和漁業生態環境監測，E-mail：cnjs3385@163.com。

TS207.3

A

1002-0306(2016)23-0316-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.23.050